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Marquage nucléotidique non radioactif compatible avec la transcriptase inverse ?

Marquage nucléotidique non radioactif compatible avec la transcriptase inverse ?


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Existe-t-il des méthodes de marquage des nucléotides compatibles avec une utilisation pour la transcription inverse, outre le radiomarquage, et pour lesquelles le cadre réglementaire de l'UE / USA est permissif ? Les obligations réglementaires autour des radionucléides étant trop strictes.


Les nucléotides marqués à la biotine peuvent être incorporés dans l'ADNc par transcriptase inverse. Jena Bioscience, un fournisseur de nucléotides marqués à la biotine, a un tableau montrant quelles chimies nucléotidiques ont été utilisées avec succès avec la transcriptase inverse, bien que vous deviez vous plonger dans les fiches techniques de produits spécifiques pour obtenir les références.

Une référence fournie sur la page du produit pour la biotine-11-dCTP :

APOBEC3G inhibe l'allongement des transcriptions inverses du VIH-1

Cette étude examine la transcription inverse endogène naturelle (nERT) dans le VIH. A partir des méthodes :

Pour ce dosage, une réaction nERT a été réalisée essentiellement comme ci-dessus, à l'exception de l'ajout de dNTP : les virions culottés ont été remis en suspension dans du PBS, 2,5 mM de MgCl2, 15 µg/ml de mélittine et 0,5 mM de biotine-11-dCTP (Jena Bioscience), et incubé à 37°C.


Oui, la biotine est une option non radioactive utilisée pour le marquage des nucléotides. Diverses enzymes utilisées pour incorporer ce nucléotide marqué à la biotine sont les suivantes : Taq Polymerase for Ploymerase Chain Reaction, DNA Polymerase for Nick Translation, Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase for Reverse Transcription, Klenow Exonuclease for Primer Extension et Terminal deoxynucleotidyl Transferase pour le marquage 3'-end.

La détection de ces sondes marquées à la Biotine se fait à l'aide de streptavidine conjuguée à une peroxydase de raifort, de la phosphatase alcaline ou de l'agarose/billes magnétiques.

(Via : https://www.jenabioscience.com/probes-epigenetics/dna-cdna-labeling/hapten-labeling-of-dna-cdna/biotinylated-nucleotides

https://www.promocell.com/f/product-information/manual/PK-CA-BIO-DUTP-1000P.pdf)


SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster

Colorant de référence ROX
Le mélange peut également être utilisé en combinaison avec le colorant de référence ROX (#PCR-351) dans des instruments PCR compatibles avec l'évaluation du signal ROX.

Teneur:
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster
2x conc. mélange de transcriptase inverse, polymérase Hot Start bloquée par anticorps, dNTP, colorant intercalant SYBR® Green DNA, tampon de réaction, additifs et stabilisants

Tampon d'extraction (Veuillez manipuler avec soin et porter un équipement de protection individuelle !)
10x conc.


Procédure
Avant de commencer, sortez les réactifs du réfrigérateur et laissez-les décongeler complètement. Vortexer brièvement tous les réactifs et essorer les liquides.

1. Préparation de l'échantillon
1.a Sang total (non recommandé pour le sang total traité à l'héparine, à l'EDTA ou au citrate)

  • Ajouter du sang total (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) sans aucun prétraitement directement au dosage qPCR


1.b Échantillons provenant d'écouvillons nasaux ou pharyngés

  • Diluer 10x le tampon d'extraction à 1x avec de l'eau de qualité PCR
  • Transférer 200 l de tampon d'extraction 1x dans un microtube de 1,5 ml
  • Coupez la pointe de coton avec le tampon nasal ou de gorge collecté et placez-le dans le micro tube
  • Fermer le tube et vortexer pendant 15 secondes
  • Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 2-3 min
  • Retirez le coton-tige et pressez-le sur le bord du tube
  • Centrifuger brièvement et transférer 1-5 l du surnageant (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) dans le dosage RT-qPCR


1.c Échantillons de tissus animaux ou végétaux

  • Préparez un petit morceau de tissu animal ou végétal ne dépassant pas 8 mm de diamètre
  • Casser les graines de plantes à moins de 1 mm de diamètre à l'aide d'un BeadBeater, d'un Tissue Lyser ou d'un petit marteau
  • Placer l'échantillon dans un microtube de 1,5 ml
  • Ajoutez le tampon d'extraction à l'échantillon de tissu comme suit :
  • Mélanger brièvement en tapotant ou en vortexant et s'assurer que l'échantillon est imbibé de tampon d'extraction
  • Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 3 min
  • Centrifuger brièvement et transférer 1-5 l du surnageant (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) dans le dosage RT-qPCR
  • Si l'échantillon est liquide: Diluer 10x le tampon d'extraction à 2x avec de l'eau de qualité PCR. Ajoutez 2x tampon d'extraction à votre échantillon dans un rapport de 1:1.

2. Préparation du test PCR
La préparation d'un master mix est cruciale dans les réactions PCR quantitatives pour réduire les erreurs de pipetage. Préparez un master mix de tous les composants, à l'exception du modèle, comme spécifié ci-dessous. Un volume de réaction de 20-50 &mul est recommandé pour la plupart des instruments en temps réel. Pipeter avec des pointes filtrantes stériles et minimiser l'exposition de la sonde d'ADN marquée à la lumière. Effectuez la configuration dans une zone distincte de la préparation ou de l'analyse de l'ADN. Des contrôles sans gabarit doivent être inclus dans toutes les amplifications.

composantconc.conc.20 &mul
essai
50 &mul
essai
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster2x1 fois10 &mul25 &mul
Échantillon extrait ou sang total--1-2 &mul2-5 &mul
Amorce avant 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
Inverser l'amorce 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
Colorant de référence ROX
#PCR-351 2)
25 &muM500 nM0,4 &mul1 &mul
Eau de qualité PCR--remplir jusqu'à
20 &mul
remplir jusqu'à
50 &mul

Mélanger brièvement les tubes et essorer pour éliminer les bulles.
3. Cycle RT-PCR
Allumez le cycleur PCR en temps réel et définissez tous les paramètres de cycle comme recommandé dans le tableau ci-dessous. Placer les flacons dans l'instrument et démarrer le programme.

Inverser
transcription 3)
50-55 °C10-15 minutes1 fois
Initiale
dénaturation
95 °C5 minutes1 fois
Dénaturation
recuit
Élongation
95 °C
60-65 °C 4)
72°C
15 secondes
20-30 secondes
30-60 secondes 5)

35-45x

Pour obtenir une spécificité et des résultats d'amplification optimaux, une optimisation individuelle des paramètres recommandés est recommandée pour chaque paire échantillon/amorce particulière.


La transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont critiques pour de nombreuses applications de biologie moléculaire et apparentées, en particulier pour les applications d'analyse d'expression génique. Dans ces applications, la transcription inverse est utilisée pour préparer l'ADN matrice (par exemple, l'ADNc) à partir d'un échantillon d'ARN initial (par exemple, l'ARNm), lequel ADN matrice est ensuite amplifié par PCR pour produire une quantité suffisante de produit amplifié pour l'application d'intérêt.

Les étapes RT et PCR d'amplification d'ADN peuvent être réalisées sous la forme d'un processus en deux étapes ou en une étape.

Dans un type de procédé en deux étapes, la première étape implique la synthèse du premier brin d'ADNc avec une transcriptase inverse, suivie d'une seconde étape de PCR. Dans certains protocoles, ces étapes sont réalisées dans des tubes réactionnels séparés. Dans ces deux protocoles de tubes, après transcription inverse de la matrice d'ARN initiale dans le premier tube, une aliquote du produit résultant est ensuite placée dans le deuxième tube PCR et soumise à une amplification PCR.

Dans un deuxième type de procédé en deux étapes, la RT et la PCR sont réalisées dans le même tube en utilisant un tampon compatible RT et PCR. En règle générale, la transcription inverse est effectuée en premier, suivie de l'ajout de réactifs PCR au tube de réaction et de la PCR ultérieure.

Une variété de protocoles de RT-PCR en une étape ont été développés, voir Blain & Goff, J. Biol. Chem. (1993) 5: 23585-23592 Blain & Goff J. Virol. (1995) 69:4440-4452 Sellner et al., J. Virol. Méthode. (1994) 49:47-58 PCR, Essential Techniques (éd. J.F. Burke, J. Wiley & Sons, New York) (1996) pp61-63 80-81.

Certains systèmes en une étape sont disponibles dans le commerce, par exemple, la description du système RT-PCR en une étape SuperScript sur le World Wide Web à l'adresse lifetech.com/world_whatsnew/archive/nz 1--3 .html Access RT-PCR System et Access RT-PCR Introduction System décrits sur le World Wide Web à l'adresse promega.com/tbs/tb220/tb220.html Kits PCR AdvanTaq et AdvanTaq Plus et manuel de l'utilisateur disponibles sur www.clontech.com, et Kit RT-PCR monotube ProSTAR™ HF (Stratagene, n° de catalogue 600164, informations disponibles sur le World Wide Web à stratagene.com).

La transcription inverse est couramment réalisée avec des transcriptases inverses virales isolées du virus de la mycloblastose aviaire (AMV-RT) ou du virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV-RT), qui sont actifs en présence d'ions magnésium.

Certains procédés de RT-PCR utilisent un mélange d'enzymes ou des enzymes avec à la fois des activités de transcriptase inverse et d'ADN polymérase ou exonucléase, par exemple, comme décrit dans les brevets U.S. Nos. 6 468 775 6 399 320 5 310 652 6 300 073 demande de brevet n° U.S. 2002/0119465A1 EP 1 132 470A1 et WO 00/71739A1, tous étant incorporés ici à titre de référence.

Certains procédés existants de RT-PCR en une étape utilisent l'activité de transcriptase inverse native des ADN polymérases d'organismes thermophiles qui sont actifs à des températures plus élevées, par exemple, comme décrit dans les références citées ci-dessus ici, et dans les brevets U.S. Nos. Nos. 5 310 652, 6 399 320, 5 322 770 et 6 436 677 Myers et Gelfand, 1991, Biochem., 30:7661-7666, qui sont tous incorporés ici à titre de référence. Les ADN polymérases thermostables avec des activités de transcriptase inverse sont couramment isolées des espèces Thermus.

Récemment, la demande de brevet U.S. 2002/0012970 (incorporée ici à titre de référence) décrit la modification d'une ADN polymérase thermostable pour obtenir une activité RT pour une réaction RT-PCR combinée.


SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster UNG

La description:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster UNG est conçu pour les analyses quantitatives en temps réel de modèles d'ARN à l'aide de sondes fluorescentes à double marquage. Le mélange prêt à l'emploi est basé sur une transcriptase inverse génétiquement modifiée avec une stabilité thermique améliorée offrant une spécificité accrue, un rendement élevé en ADNc et une efficacité améliorée pour les fragments d'ADNc longs et hautement structurés.
Le 2x conc. mix contient tous les réactifs requis pour la RT-qPCR (à l'exception de la matrice, des amorces et de la sonde fluorescente à double marquage) pour assurer une préparation rapide et facile avec un minimum d'étapes de pipetage. Les enzymes de qualité supérieure et le tampon de réaction optimisé contenant des dNTP ultrapurs garantissent des résultats de PCR en temps réel supérieurs.

Le mélange contient de l'UNG (Uracil-N-Glycosylase) et du dUTP au lieu du dTTP pour éliminer la contamination résiduelle de l'ADN des réactions PCR précédentes. Le traitement UNG au début du cycle thermique élimine les résidus d'uracile de l'ADN contenant du dU et l'empêche de servir de matrice.

La RT-qPCR est utilisée pour amplifier l'ADN double brin à partir de matrices d'ARN simple brin afin de permettre une quantification rapide en temps réel des cibles ARN. Dans l'étape de transcription inverse, la transcriptase inverse synthétise des molécules d'ADN simple brin (ADNc) complémentaires de la matrice d'ARN. Dans le premier cycle de l'étape de PCR, l'ADN polymérase de démarrage à chaud synthétise des molécules d'ADN complémentaires à l'ADNc, générant ainsi une matrice d'ADN double brin. L'activité polymérase hot-start est bloquée à température ambiante et activée automatiquement au début de la dénaturation initiale. L'activation thermique empêche l'extension des amorces non spécifiquement recuites et des formations d'amorces-dimères à basse température pendant la configuration de la PCR.
La RT-qPCR en une étape offre une grande commodité lorsqu'elle est appliquée à l'analyse de cibles à partir de plusieurs échantillons d'ARN et minimise le risque de contamination.
Le mélange peut également être utilisé en combinaison avec le colorant de référence ROX (#PCR-351) dans des instruments PCR compatibles avec l'évaluation du signal ROX.

Le maître des sondes SCRIP RT-qPCR est validé pour le diagnostic moléculaire du SRAS-CoV-2 à l'origine de la nouvelle maladie infectieuse à coronavirus COVID-19.

Teneur:
SCRIPT RT-qPCR ProbesMaster UNG
Mélange prêt à l'emploi de SCRIPT Reverse Transcriptase, Hot Start Polymerase AB+, UNG, RNase Inhibitor, dNTP incl. dUTP, tampon de réaction et stabilisants.


Sondes fluorescentes à double marquage :
La technologie PCR en temps réel basée sur des sondes d'ADN à double marquage fournit un système PCR hautement sensible et spécifique avec une capacité de multiplexage. Il nécessite deux amorces PCR standard et la sonde ADN qui s'hybride à une partie interne de l'amplicon. La séquence de la sonde d'ADN doublement marquée doit éviter la formation de structure secondaire et d'amorce-dimère.

Continuez avec la transcription inverse et le cycle thermique comme recommandé.

Transcription inverse et cyclage thermique :
Placer les flacons dans un cycleur PCR et démarrer le programme suivant.

inverser
transcription 5)
50-55 °C20-30 minutes1 fois
initiale
dénaturation 6)
95°C5 minutes1 fois
dénaturation95°C15 secondes35-45x
recuit et
élongation
60-65 °C 7) 40-60 secondes 6) 35-45x

Pour une spécificité et une amplification optimales, une optimisation individuelle des paramètres recommandés peut être nécessaire. Notez que les temps de réaction et les températures optimales doivent être ajustés pour chaque paire ARN/amorce particulière.


SCRIPT Direct RT-qPCR ProbesMaster

Colorant de référence ROX
Le mélange peut également être utilisé en combinaison avec le colorant de référence ROX (#PCR-351) dans des instruments PCR compatibles avec l'évaluation du signal ROX.

Teneur:
SCRIPT Direct RT-qPCR ProbesMaster
2x conc. mélange de transcriptase inverse, polymérase Hot Start bloquée par anticorps, dNTP, tampon de réaction, additifs et stabilisants

Tampon d'extraction (Veuillez manipuler avec soin et porter un équipement de protection individuelle !)
10x conc.


Procédure
Avant de commencer, sortez les réactifs du réfrigérateur et laissez-les décongeler complètement. Vortexer brièvement tous les réactifs et essorer les liquides.

1. Préparation de l'échantillon
1.a Sang total (non recommandé pour le sang total traité à l'héparine, à l'EDTA ou au citrate)

  • Ajouter du sang total (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) sans aucun prétraitement directement au dosage qPCR


1.b Échantillons provenant de prélèvements nasaux ou de gorge

  • Diluer 10x le tampon d'extraction à 1x avec de l'eau de qualité PCR
  • Transférer 200 l de tampon d'extraction 1x dans un microtube de 1,5 ml
  • Coupez le coton-tige avec le tampon nasal ou de gorge collecté et placez-le dans le micro tube
  • Fermer le tube et vortexer pendant 15 secondes
  • Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 2-3 min
  • Retirez le coton-tige et pressez-le sur le bord du tube
  • Centrifuger brièvement et transférer 1-5 l du surnageant (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) dans le dosage RT-qPCR


1.c Échantillons de tissus animaux ou végétaux

  • Préparez un petit morceau de tissu animal ou végétal ne dépassant pas 8 mm de diamètre
  • Casser les graines de plantes à moins de 1 mm de diamètre à l'aide d'un BeadBeater, d'un Tissue Lyser ou d'un petit marteau
  • Placer l'échantillon dans un microtube de 1,5 ml
  • Ajoutez le tampon d'extraction à l'échantillon de tissu comme suit :
  • Mélanger brièvement en tapotant ou en vortexant et s'assurer que l'échantillon est imbibé de tampon d'extraction
  • Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 3 min
  • Centrifuger brièvement et transférer 1-5 l du surnageant (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) dans le dosage RT-qPCR
  • Si l'échantillon est liquide: Diluer 10x le tampon d'extraction à 2x avec de l'eau de qualité PCR. Ajoutez 2x tampon d'extraction à votre échantillon dans un rapport de 1:1.


2. Préparation du test PCR
La préparation d'un master mix est cruciale dans les réactions PCR quantitatives pour réduire les erreurs de pipetage. Préparez un master mix de tous les composants, à l'exception du modèle, comme spécifié ci-dessous. Un volume de réaction de 20-50 &mul est recommandé pour la plupart des instruments en temps réel. Pipeter avec des pointes filtrantes stériles et minimiser l'exposition de la sonde d'ADN marquée à la lumière. Effectuez la configuration dans une zone distincte de la préparation ou de l'analyse de l'ADN. Des contrôles sans gabarit doivent être inclus dans toutes les amplifications.

composantconc.conc.20 &mul
essai
50 &mul
essai
SCRIPT Direct RT-qPCR ProbesMaster2x1 fois10 &mul25 &mul
Échantillon extrait ou sang total--1-2 &mul2-5 &mul
Amorce avant 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
Inverser l'amorce 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
TaqMan® / Sonde à double marquage 1 1) 10 &muM200 nM0,4 &mul1 &mul
Amorce avant 2 2)10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
Inverse Primer 2 2)10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
TaqMan® / Sonde à double étiquetage 2 2)10 &muM200 nM0,4 &mul1 &mul
Colorant de référence ROX
#PCR-351 3)
25 &muM500 nM0,4 &mul1 &mul
Eau de qualité PCR--remplir jusqu'à
20 &mul
remplir jusqu'à
50 &mul

Mélanger brièvement les tubes et essorer pour éliminer les bulles.
3. RT-PCR Cyclisme
Allumez le cycleur PCR en temps réel et définissez tous les paramètres de cycle comme recommandé dans le tableau ci-dessous. Placer les flacons dans l'instrument et démarrer le programme.

Inverser
transcription 4)
50-55 °C10-15 minutes1 fois
Initiale
dénaturation
95 °C5 minutes1 fois
Dénaturation
Recuit et allongement
95 °C
60-65 °C 5)
15 secondes
30-60 secondes 6)

35-45x

Pour obtenir une spécificité et des résultats d'amplification optimaux, une optimisation individuelle des paramètres recommandés est recommandée pour chaque paire échantillon/amorce particulière.


12 - In situ PCR

In situ La réaction en chaîne par polymérase (IS-PCR) décrit l'amplification par amorce d'une matrice d'ADN ou d'ARN par PCR et sa détection ultérieure dans les limites d'une coupe de tissu histologique. Ce chapitre présente un aperçu complet de la technique IS-PCR en mettant l'accent sur les recommandations et les protocoles actuels. De plus, d'autres problèmes importants qui continuent de dissuader les chercheurs d'adopter cette technique sont discutés plus en détail. Ces problèmes sont la fixation, la perméabilité et la diffusion. Enfin, cette revue se veut une ressource pour orienter le lecteur vers des traités plus détaillés sur tous les aspects pertinents de la in situ amplification. La discussion conclut que l'IS-PCR continue de susciter beaucoup d'intérêt et de débats. La PCR en solution étant rapidement incorporée dans les tests de diagnostic, on s'attend à ce que l'IS-PCR fasse la transition. Cependant, jusqu'à ce qu'un protocole robuste et fiable soit développé et que les problèmes de diffusion et de quantification soient résolus, l'IS-PCR sera considérée comme quelque chose d'un art et par conséquent moins d'une science. À la fin, le chapitre décrit un protocole détaillé utilisé dans différents laboratoires à travers le monde pour la détection d'un gène à copie unique dans un tissu de mammifère normal.


SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster highROX

Colorant de référence ROX
Le SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster highROX contient 500 nM de colorant de référence passif ROX dans le dosage final. Le colorant ne participe pas à la réaction PCR mais permet de normaliser les variations de signal non liées à la PCR dans les instruments compatibles avec l'évaluation du signal de référence ROX.

Teneur:
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster highROX
2 x conc. mélange de transcriptase inverse, polymérase Hot Start bloquée par anticorps, dNTP, colorant intercalant SYBR® Green DNA, ROX, tampon de réaction, additifs et stabilisant

Tampon d'extraction (Veuillez manipuler avec soin et porter un équipement de protection individuelle !)
10x conc.

Procédure
Avant de commencer, sortir les réactifs du réfrigérateur et laisser décongeler complètement. Vortexer brièvement tous les réactifs et essorer les liquides.

1. Préparation de l'échantillon
1.a Sang total (déconseillé pour le sang total traité à l'héparine, à l'EDTA ou au citrate)

  • Ajouter du sang total (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) sans aucun prétraitement directement au dosage qPCR


1.b Échantillons provenant de prélèvements nasaux ou de gorge

  • Diluer 10x le tampon d'extraction à 1x avec de l'eau de qualité PCR
  • Transférer 200 l de tampon d'extraction 1x dans un microtube de 1,5 ml
  • Coupez la pointe de coton avec le tampon nasal ou de gorge collecté et placez-le dans le micro tube
  • Fermer le tube et vortexer pendant 15 secondes
  • Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 2-3 min
  • Retirez le coton-tige et pressez-le sur le bord du tube
  • Centrifuger brièvement et transférer 1-5 l du surnageant (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) dans le dosage RT-qPCR


1.c Échantillons de tissus animaux ou végétaux

  • Préparer un petit morceau de tissu animal ou végétal ne dépassant pas 8 mm de diamètre
  • Casser les graines de plantes à moins de 1 mm de diamètre à l'aide d'un BeadBeater, d'un Tissue Lyser ou d'un petit marteau
  • Placer l'échantillon dans un microtube de 1,5 ml
  • Ajoutez le tampon d'extraction à l'échantillon de tissu comme suit :
  • Mélanger brièvement en tapotant ou en vortexant et s'assurer que l'échantillon est imbibé de tampon d'extraction
  • Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 3 min
  • Centrifuger brièvement et transférer 1-5 l du surnageant (1-2 &mul pour 20 &mul ou 2-5 &mul pour 50 &mul de volume de dosage total) dans le dosage RT-qPCR
  • Si l'échantillon est liquide: Diluer 10x le tampon d'extraction à 2x avec de l'eau de qualité PCR. Ajoutez 2x tampon d'extraction à votre échantillon dans un rapport de 1:1.

2. Préparation du test PCR
La préparation d'un master mix est cruciale dans les réactions PCR quantitatives pour réduire les erreurs de pipetage. Préparez un master mix de tous les composants, à l'exception du modèle, comme spécifié ci-dessous. Un volume de réaction de 20-50 &mul est recommandé pour la plupart des instruments en temps réel. Pipeter avec des pointes filtrantes stériles et minimiser l'exposition de la sonde d'ADN marquée à la lumière. Effectuez la configuration dans une zone distincte de la préparation ou de l'analyse de l'ADN. Des contrôles sans gabarit doivent être inclus dans toutes les amplifications.

composantconc.conc.20 &mul
essai
50 &mul
essai
SCRIPT Direct RT-qPCR SybrMaster2x1 fois10 &mul25 &mul
Échantillon extrait ou sang total--1-2 &mul2-5 &mul
Amorce avant 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
Inverser l'amorce 1 1) 10 &muM300 nM0,6 &mul1.5 &mul
Eau de qualité PCR--remplir jusqu'à
20 &mul
remplir jusqu'à
50 &mul

Mélanger brièvement les tubes et essorer pour éliminer les bulles.
3. Cycle RT-PCR
Allumez le cycleur PCR en temps réel et définissez tous les paramètres de cycle comme recommandé dans le tableau ci-dessous. Placer les flacons dans l'instrument et démarrer le programme.

Inverser
transcription 2)
50-55 °C10-15 minutes1 fois
Initiale
dénaturation
95 °C5 minutes1 fois
Dénaturation
recuit
Élongation
95 °C
60-65 °C 3)
72°C
15 secondes
20-30 secondes
30-60 secondes 4)

35-45x

Pour obtenir une spécificité et des résultats d'amplification optimaux, une optimisation individuelle des paramètres recommandés est recommandée pour chaque paire échantillon/amorce particulière.


Manuel technique avidine-biotine

Notre manuel technique Avidine-Biotine de 48 pages rassemble tout le nécessaire pour biotinyler, purifier ou détecter les protéines. Les produits présentés comprennent des kits de biotinylation et de purification de protéines de surface cellulaire, le marquage d'anticorps et de nouveaux réactifs de biotinylation photoréactifs. Ce manuel comprend des dizaines de références ainsi que des protocoles, des conseils de dépannage, des guides de sélection et une liste complète des outils disponibles.

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Inconvénients de l'utilisation du système Avidine-biotine

Bien que le système Avidine-biotine soit simple à installer et à utiliser, il présente certaines limites. Étant donné que toute molécule biotinylée se lie à toute protéine de liaison à la biotine, ces réactifs doivent être utilisés en combinaison avec d'autres systèmes de sonde de détection (c'est-à-dire des anticorps primaires-secondaires) pour les expériences multiplex.

De plus, étant donné que la biotine est une molécule biologique, la biotine endogène peut entraîner des problèmes de fond et de spécificité lors de la réalisation d'analyses avec certains tissus et extraits riches en biotine (c'est-à-dire cerveau, foie, lait, œufs, maïs). Ceci s'applique également aux échantillons contenant des protéines endogènes de liaison à la biotine telles que les œufs (source d'avidine) ou des bactéries comme Streptomyces avidinii (source de streptavidine).

Structure chimique de HNS-Desthiobiotine. Notez la structure en anneau modifiée sur la droite (la biotine native a une structure en double anneau qui s'insère dans le site de liaison de l'Avidine, de la Streptavidine ou de la NeutrAvidine).

Pour les applications de purification, la force de l'interaction de liaison entre la biotine et l'avidine est un facteur qui limite son utilité. En effet, des conditions difficiles sont nécessaires pour rompre les liaisons avidine-biotine (c'est-à-dire pour se dissocier et éluer), et celles-ci peuvent dénaturer les protéines cibles. Pour surmonter cette limitation, des versions modifiées de résines d'avidine et des formes modifiées de réactifs de marquage à la biotine sont disponibles dans le commerce, ce qui rend l'interaction facilement réversible. Ceux-ci comprennent l'avidine monomère, les réactifs de biotine disulfure clivable et les dérivés d'iminobiotine et de desthiobiotine (voir la discussion sur l'isolement et l'enrichissement des protéines ci-dessous).

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Résultats

AviRa et AviRb méthylate l'ARNr 23S

Des études antérieures utilisant un donneur de groupe méthyle AdoMet tritié ont montré qu'AviRa et AviRb acceptent un mélange de E. coli ARNr 16S et 23S comme substrat pour la méthylation (Weitnauer et al., 2001 ). La co-incubation des deux enzymes avec le substrat a eu un effet additif sur l'incorporation du groupe méthyle tritié, indiquant que les enzymes agissent à différents nucléotides dans l'ARNr (ou éventuellement à différentes positions du même nucléotide). Dans cette étude, les ARNr 16S et 23S ont été préparés séparément par in vitro transcription, et seul le transcrit de l'ARNr 23S fonctionne comme substrat pour chacune des deux enzymes. Dans les conditions de dosage utilisées ici, les quantités de tritium incorporées indiquaient que chacune des enzymes ajoutait approximativement un groupe méthyle par molécule de substrat d'ARNr 23S (tableau 1). Aucune incorporation significative de tritium n'a été observée dans les tentatives d'utilisation du transcrit d'ARNr 16S comme substrat (données non présentées).

Plasmide Position dans l'ARN 23S Transcription d'ARN Formation du produit a
AviRa AviRb
pCW1 ARNr 23S entier 2904n 0.86 ± 0.05 1 ± 0.05
pBDV 2031–2637 607n 0.81 ± 0.07 0.98 ± 0.12
pBDVCL 2446–2632 187n 0.81 ± 0.05 0.88 ± 0.07
pBDVCL2 2446–2532 87n ≤ 0.05 0.79 ± 0.07
  • une. La quantité d'ARN méthylé est donnée en mole de groupes méthyle incorporés par mole d'ARN. Les valeurs sont les moyennes de deux expériences indépendantes.

AviRa et AviRb agissent à différents endroits dans l'ARNr 23S

Afin de localiser les sites de méthylation par AviRa et AviRb, plusieurs transcrits d'ARN ont été générés à partir de plasmides contenant des portions tronquées du gène d'ARNr 23S (tableau 1 et figure 2). Un transcrit de 606 nucléotides (606n) comprenant l'intégralité du domaine V de l'ARNr 23S a été accepté comme substrat par les deux enzymes et les sites de méthylation ont pu être encore réduits à l'aide d'un transcrit 187n qui contient la séquence du domaine V de l'ARNr 23S du nucléotide 2446– 2632, qui comprend les hélices 89-91. Après une nouvelle troncature pour éliminer la majeure partie de l'hélice 91 (dans le transcrit 87n), l'activité de méthylation d'AviRa a été perdue bien que la méthylation d'AviRb ait été conservée (tableau 1). Ces résultats ont indiqué qu'AviRa et AviRb reconnaissent différentes structures dans la région de l'hélice 89-91.

Identification des sites de méthylation AviRa et AviRb

Les transcrits d'ARN méthylés ont été analysés par extension d'amorce avec une transcriptase inverse pour identifier les positions exactes des nucléotides qui sont modifiés par les deux méthyltransférases. L'extension à partir d'une amorce qui s'hybride à la séquence d'ARNr 23S 2559-2578 a donné des arrêts uniques de transcriptase inverse pour chacune des deux méthylations (Fig. 3). La méthylation de l'ARN par AviRa a donné lieu à un arrêt de transcription important à la position 2536 dans l'hélice 91, ce qui est cohérent avec une modification au niveau du nucléotide adjacent (G2535). L'analyse de l'ARN méthylé par AviRb a montré un léger arrêt de la transcriptase inverse à la position 2480, correspondant à une modification au nucléotide U2479 dans l'hélice 89. Aucun autre nouvel arrêt n'était évident à d'autres positions dans le domaine V de l'ARNr 23S.

Autoradiogramme sur gel révélant les sites de méthylation d'AviRa et d'AviRb. Après avoir été méthylé par AviRa (piste a) ou AviRb (piste b), in vitro les transcrits de l'ARNr 23S ont été rétrotranscrits à partir de l'amorce ln05. Les arrêts de la reverse transcriptase, correspondant aux sites de modification nucléotidique en G2535 et U2479, sont indiqués. Ces arrêts sont absents dans le transcrit d'ARN de contrôle non modifié (piste k) et dans l'ARNr 23S non modifié extrait de E. coli cellules (piste o). Les voies de séquençage didésoxy (C, U, A et G) ont été générées en utilisant le E. coli ARNr 23S comme matrice. Les arrêts dépendant de la méthylation se produisent un nucléotide avant la position correspondante dans les voies de séquençage.

Le fort arrêt dépendant d'AviRa à G2535 correspondait bien aux expériences de méthylation utilisant de l'AdoMet tritié, tandis que le faible arrêt causé par AviRb-méthylation à U2479 était difficile à concilier avec la stoechiométrie de l'incorporation de groupes méthyle tritiés dans les substrats d'ARN. Il a déjà été démontré que les méthylations 2′-hydroxyle ont peu d'effet sur le ralentissement de la transcriptase inverse dans des conditions d'extension d'amorce standard, bien que l'abaissement des concentrations de désoxynucléoside triphosphate dans la réaction d'extension augmente la terminaison au niveau de ces nucléotides méthylés ( Maden et al., 1995 ). La répétition des extensions d'amorces avec des quantités progressivement plus faibles de dNTP a spécifiquement amélioré la terminaison au site U2479 dans l'ARN méthylé d'AviRb (Fig. 4). Dans les extensions de contrôle utilisant E. coli ARNr 23S, une augmentation similaire de l'intensité de la bande a été notée pour U2552, qui est intrinsèquement méthylé au niveau du 2′-hydroxyle ( Rozenski et al., 1999 ). Cela suggère fortement qu'AviRb cible la position 2' du nucléotide U2479 ribose.

Autoradiogrammes sur gel (panneau de gauche) d'ARNr 23S extrait de E. coli (ARNr 23S) et une ARN polymérase T7 in vitro transcrit de la même séquence (ARN T7) qui ont été rétrotranscrits à partir de l'amorce ln05 sous différentes concentrations de dNTP. Les coins indiquent une baisse de la concentration de dNTP de 220 µM, 40 µM, 20 µM à 10 µM. La méthylation intrinsèque de l'ARNr 23S 2′-0-ribose à U2552 devient apparente aux concentrations de dNTP inférieures et est absente dans le transcrit de l'ARN T7. Dans le panneau de droite, le transcrit de l'ARN T7 a été reverse transcrit avant (pas d'enzyme) et après modification par l'AviRb méthyltransférase (AviRb). Ces ARN ont été rétrotranscrits à partir de l'amorce complémentaire des nucléotides 2488–2504 en utilisant la plage de concentrations de dNTP indiquée par les coins (220 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM et 1 µM). La bande dépendante d'AviRb correspondant au nucléotide modifié U2479 est la plus apparente aux concentrations de dNTP inférieures.

Analyses par spectrométrie de masse MALDI-TOF des méthylations d'ARN

Le transcrit d'ARN 187n a été méthylé par AviRa ou AviRb, puis a été complètement digéré avec la RNase A ou la RNase T1. La digestion par nucléase réduit le 187n à une série d'oligonucléotides spécifiques, dont les masses exactes peuvent être calculées à partir de la séquence d'ARN et mesurées par spectrométrie de masse. Une modification nucléotidique se traduira par un écart entre les masses calculées et mesurées ( Kirpekar et al., 2000 ). Dans les spectres de masse complets, les oligonucléotides plus gros que les dinucléotides peuvent être détectés et attribués avec une précision de masse meilleure que 0,2 Da.

La modification de l'ARN 187n avec AviRa suivie d'une digestion par la RNase T1 a produit une série d'oligonucléotides (Fig. 5A) dont un qui était absent dans l'ARN non méthylé. Ce fragment avait un m/z de 1013,07, correspondant à UAGp plus un groupe méthyle (m/z théorique 1013,16). L'UAGp méthylé a été analysé plus en détail par spectrométrie de masse en tandem (figure 5B), une technique utilisée pour sélectionner et ensuite fragmenter des oligonucléotides spécifiques. Du y2- Andy1-ions (nomenclature selon McLuckey et al., 1992), le site de méthylation a pu être attribué sans ambiguïté au nucléotide guanosine. De plus, la perte d'une G-nucléobase méthylée de l'UAGp donne un signal à m/z 848,12 (m/z théorique 848,13) plus une espèce guanine protonée à 166,08 et cela montre de manière concluante que le groupe méthyle est situé sur la base guanine, et pas sur le ribose, de G2535. La digestion par la RNase A analogue a donné lieu à un signal à m/z 1358,20, correspondant à un oligonucléotide AGGUp méthylé et une analyse ultérieure a confirmé que la méthylation était à G2535 (données non présentées).

A. Spectre de masse MALDI de l'ARN 187n après méthylation par AviRa et digestion complète avec la RNase T1. Tous les fragments calculés plus gros que les dinucléotides ont été détectés et attribués avec une précision de masse meilleure que 0,2 Da. L'insert montre un grossissement de la région de 1000 m/z où se trouve le pic correspondant à UAGp plus un seul groupe méthyle (mesuré à m/z 1013,07).

B. Fragmentation par spectrométrie de masse en tandem du pic UAGp méthylé (remesuré à m/z 1013,19). La perte de la base guanine méthylée de l'UAGp entraîne un pic de m/z 848,13 (– G Me H), et l'ion guanine protoné apparaît à 166,08 (G Me H2 + ). Tous les spectres ont été lissés.

Après méthylation de l'ARN 187n par AviRb suivie d'une digestion par la RNase T1, le m/z d'un des fragments correspondait à la séquence 5'-UUCAUAUCGp-3' plus un groupement méthyle (non représenté). La digestion de l'ARN avec la RNase A a localisé la méthylation au sein du plus grand oligonucléotide T1 à la séquence AUCp, qui a donné un signal à 973.15 (le m/z théorique de cet oligonucléotide avec un seul groupe méthyle est de 973.11). L'oligonucléotide AUCp n'a pas été obtenu pour l'ARN non méthylé, car la RNase A coupe après un résidu U non modifié, indiquant que le nucléotide U2479 a été méthylé d'une manière qui inhibe le clivage de la RNase A. Une analyse plus poussée de l'oligonucléotide AUCp par MS en tandem (Fig. 6) a donné un spectre de y2-, z1 et C1-ions que l'on peut clairement attribuer à la séquence HO-A[méthylé U]Cp. Le signal distinct à m/z 111,05 (insertion de la figure 6) correspond à un dérivé connu du ribose ( Phillips et McCloskey, 1993 Kirpekar et Krogh, 2001 ) avec un groupe méthyle attaché. A partir de ces données, la cible AviRb pour la méthylation peut être attribuée au ribose du nucléotide U2479.

Fragmentation par spectrométrie de masse en tandem de l'UAmPic de Cp (mesuré à m/z 973,15). Ce pic a été observé dans le spectre MALDI-TOF (non illustré) dérivé du substrat d'ARN 187n après méthylation par AviRb suivie d'une digestion avec la RNase A. La région située dans la plage m/z inférieure du spectre est agrandie (insert) révélant un pic correspondant au 2'-0-méthyl ribose (m/z 111,05) dérivé de U2479.


ICLIP -- Transcriptome لى صعيد الخرائط من البروتين ARN التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

الترتيب المكاني للRNA البروتينات لزم لى المحددات الرئيسية لمرحلة ا النسخي التنظيم. ولذلك ، قمنا بتطوير الفرد والأشعة فوق البنفسجية النوكليوتيدات يشابك القرار ومناعي (iCLIP) الذي يسمح دقيقة الجينوم على نطاق ورسم خرائط للمواقع الملزم للبروتين النووي الريبي ملزمة.

Résumé

تركيبة فريدة والترتيب المكاني للRNA ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) على نسخة دليل الجوانب المتنوعة في مرحلة ما بعد النسخي البند 1. لذلك ، خطوة أساسية نحو تنظيم محضر التفاهم على المستوى الجزيئي هي لاكتساب المعلومات الموضعية على مواقع الربط من الممارسات التجارية التقييدية 2.

ويمكن دراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعلات الكيميائية الحيوية باستخدام الأساليب ، ولكن هذه الطرق لا تتناول الحمض النووي الريبي ملزمة في سياقها الأصلي الخلوية. المحاولات الأولية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات في بيئتها الخلوية المستخدمة لتنقية تقارب أو مناعي جنبا إلى جنب مع الفرق عرض أو تحليل ميكروأري (RIP - CHIP) 3-5. وكانت هذه الأساليب عرضة لتحديد التفاعلات غير المباشرة أو غير الفسيولوجية - 6. يشار استراتيجية من أجل زيادة نوعية والقرار الموضعية ، على أنه قدم CLIP (الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط ومناعي) 7،8. CLIP يجمع عبر ربط الأشعة فوق البنفسجية من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي مع مخططات تنقية صارمة بما في ذلك تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام إستشراد. بالاشتراك مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، وقد ثبت CLIP كأداة قوية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعل على نطاق والجينوم واسعة (ويشار إلى CLIP - HITS CLIP أو بعدها) 9،10. مؤخرا ، تم إدخال PAR - CLIP يستخدم النظير لريبونوكليوزيد photoreactive عبر ربط 11،12.

على الرغم من نوعية عالية من البيانات التي تم الحصول عليها ، والتجارب CLIP كثيرا ما تولد من التعقيد مكتبات [كدنا] تسلسل محدودة. هذا يرجع جزئيا إلى كمية محدودة من شارك في المنقى واثنين من الحمض النووي الريبي RNA ربط الكفاءة ردود الفعل المطلوبة لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت المقايسات تمديد التمهيدي cDNAs أن العديد من اقتطاع قبل الأوان بنسبة 13 في النوكليوتيدات crosslinked. يتم فقدان هذه cDNAs اقتطاع خلال بروتوكول CLIP معيار إعداد المكتبة. نحن وضعت مؤخرا iCLIP (فردية النوكليوتيدات CLIP القرار) ، والذي يجسد cDNAs اقتطاعها من خلال استبدال واحدة من الخطوات غير فعالة الربط بين الجزيئات RNA مع التعميم أكثر كفاءة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ [كدنا] (الشكل 1) 14. الأهم من ذلك ، تسلسل cDNAs اقتطاع يقدم أفكارا في موقف للموقع عبر وصلة في القرار النوكليوتيدات. طبقنا بنجاح iCLIP لدراسة الجسيمات C hnRNP منظمة على نطاق واسع الجينوم وتقييم دورها في تنظيم الربط 14.

Protocole

1. الأشعة فوق البنفسجية عبر الربط بين خلايا الأنسجة

  1. إزالة وسائل الاعلام وإضافة 6 مل الجليد الباردة PBS إلى الخلايا المزروعة في صحن 10 سم (ما يكفي لمدة ثلاث تجارب).
  2. إزالة غطاء ووضعت على الجليد. أشرق مرة واحدة مع 150 ميغا جول / سم 2 في 254 نانومتر.
  3. حصاد الخلايا عن طريق كشط مع رافع الخلية.
  4. 2 تعليق نقل خلية لكل مل من ثلاثة microtubes. تدور بسرعة أعلى لمدة 10 ثانية عند 4 درجة مئوية إلى الخلايا بيليه ، ثم إزالة طاف.
  5. الإضافية تجميد الخلية في كريات الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  1. إضافة 100 ميكرولتر من البروتين Dynabeads (Dynal ، 100،02) في تجربة جديدة لmicrotube (استخدام البروتين Dynabeads G للماوس أو أجسام الماعز).
  2. تغسل حبات 2X مع تحلل العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ؛ 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ 0.5 ٪ deoxycholate الصوديوم ؛ 1 / 100 مثبط البروتياز كوكتيل الثالث ، Calbiochem).
  3. Resuspend الخرز في 100 العازلة تحلل ميكرولتر مع الضد 20-10 ميكروغرام.
  4. تدوير أنابيب في درجة حرارة الغرفة ل30-60 دقيقة.
  5. غسل 3X مع 900 ميكرولتر العازلة تحلل وترك في الماضي حتى يغسل استعداد للشروع في الخطوة 4.1.

3. تحلل الخلايا والحمض النووي الريبي الهضم الجزئي

  1. Resuspend الكرية خلية في 1 مل العازلة تحلل ونقل إلى microtubes مل 1.5.
  2. يعد التخفيف 1 / 500 من أنا ريبونوكلياز (Ambion ، AM2295). أضف 10 ميكرولتر التخفيف أنا ريبونوكلياز فضلا عن 2 الدناز توربو ميكرولتر إلى lysate الخلية (1 / 500 ريبونوكلياز التخفيفات الأول [منخفضة ريبونوكلياز] تستخدم لإعداد المكتبة ، 1 / ​​50 التخفيفات [عالية ريبونوكلياز] ضرورية للسيطرة على خصوصية الضد) .
  3. احتضان العينات المطلوبة لل3 دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. نقل على الفور إلى جليد.
  4. تدور عند 4 درجة مئوية و 22000 لمدة 20 دقيقة ز لمسح lysate. جمع بعناية طاف (اترك حوالي 50 lysate ميكرولتر مع بيليه).
  1. إزالة غسل العازلة من الخرز (من الخطوة 2.5) ، ثم إضافة lysate الخلية (من الخطوة 3.4).
  2. تدوير عينات لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف وتغسل حبات 2X مع 900 العازلة عالية من الملح ميكرولتر (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 1 M كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم و 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ deoxycholate الصوديوم 0.5 ٪).
  4. غسل 2X مع 900 العازلة غسل ميكرولتر (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي MgCl 2 ؛ 0.2 ٪ توين - 20).

5. نزع الفسفات من الحمض النووي الريبي 3'ends

  1. تجاهل وطاف resuspend الخرز في 20 مزيج PNK ميكرولتر (15 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر الحموضة PNK 5X 6.5 العازلة [350mMTris ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.5 ؛ 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2] ؛ 0.5 انزيم PNK ميكرولتر ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega]).
  2. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل 1X عالية مع الملح العازلة.
  4. غسل 2X مع العازلة يغسل.

6. رابط لربط الحمض النووي الريبي ينتهي 3 '

  1. إزالة بعناية وطاف resuspend الخرز في 20 ميكرولتر مزيج ربط (9 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر العازلة ربط 4X [200 mMTris - حمض الهيدروكلوريك ؛ MM 40m GCL 2 و 40 ملي dithiothreitol] ؛ 1 ميكرولتر RNA يغاز [NEB] ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega] ؛ 1.5 ميكرولتر قبل adenylated رابط L3 [20 ميكرومتر] ؛ 4 ميكرولتر PEG400 [81170 ، سيغما]).
  2. يحضن بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل ثم 2X مع 1 العازلة عالية من الملح مل.
  4. غسل 2X مع 1 مل العازلة يغسل ويترك في 1 مل من غسل الثانية.
  1. إزالة وطاف resuspend حبات في 8 ميكرولتر من مزيج PNK الساخنة (0.4 ميكرولتر PNK [NEB] ؛ 0.8 ميكرولتر 32 - P - γ ATP ؛ 0.8 ميكرولتر العازلة PNK 10X [NEB] (6) ؛ المياه ميكرولتر).
  2. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. إزالة مزيج PNK الساخنة وresuspend حبات العازلة في 20 ميكرولتر 1X تحميل Nupage (Invitrogen).
  4. على احتضان thermomixer عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. المكان فورا على مغناطيس لترسيب حبات فارغة وتحميل طاف على هلام (راجع الخطوة 8).
  1. تحميل عينات على NuPAGE 4-12 ٪ مكرر تريس هلام (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 0.5 لتر من اجتماعات الأطراف 1X تشغيل العازلة (Invitrogen). أيضا تحميل 5 ميكرولتر من علامة حجم البروتين قبل الملون (على سبيل المثال PAGE حاكم زائد ، Fermentas ، SM1811).
  2. تشغيل لمدة 50 دقيقة هلام في 180 V.
  3. إزالة الجبهة جل والتخلص من النفايات الصلبة و(يحتوي على الخطوط المشعة ATP).
  4. نقل البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات من الجل لغشاء النيتروسليلوز باستخدام جهاز نقل Novex الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen ، ونقل في 30 ح 1 V).
  5. بعد نقل ، وشطف الغشاء العازلة في برنامج تلفزيوني ، ثم لف في التفاف ساران وتعريضها لفوجي فيلم في -80 درجة مئوية (مكان ملصقا الفلورسنت بجوار الغشاء لمحاذاة في وقت لاحق رانه فيلم وغشاء ؛ أداء التعرض لمدة 30 دقيقة ، وأكثر من ليلة 1H).
  1. عزل بروتين المجمعات الحمض النووي الريبي من التجربة المنخفضة ريبونوكلياز باستخدام صورة الإشعاع الذاتي من الخطوة 8.5 كقناع. قص قطعة من هذا الغشاء إلى شرائح صغيرة عدة ووضعها في microtube مل 1.5.
  2. إضافة 200 PK ميكرولتر العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA) و 10 ميكرولتر بروتيناز K (روش ، 03115828001) إلى قطع الغشاء. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من PKurea العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA ؛ 7 M اليوريا) ، واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. جمع الحل وإضافتها معا مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفينول / الكلوروفورم (Ambion ، 9722) إلى المرحلة 2 مل أنبوب جل قفل الثقيلة (713-2536 ، VWR).
  5. احتضان لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. فصل المراحل عن طريق الدوران لمدة 5 دقائق في الدقيقة 13000 في درجة حرارة الغرفة.
  6. نقل الطبقة المائية في أنبوب جديد (يجب الحرص على عدم لمس هلام مع ماصة). إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر (Ambion ، 9510) و 40 م 3 ميكرولتر الصوديوم الهيدروجيني 5.5 وخلات المزيج. ثم إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.
  1. تدور لمدة 20 دقيقة في 15000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية. إزالة طاف بيليه ويغسل مع 0.5 مل من الايثانول 80 ٪.
  2. Resuspend الكرية 7.25 في الحمض النووي الريبي ميكرولتر / مزيج التمهيدي (6.25 ميكرولتر المياه ؛ 0.5 التمهيدي Rclip ميكرولتر [0.5pmol/μl] ؛ 0.5 ميكرولتر dNTP مزيج [10MM]). لكل تجربة أو تكرار ، واستخدام التمهيدي Rclip مختلفة تحتوي على تسلسل الباركود الفرد (انظر 14).
  3. احتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية قبل التبريد إلى 25 درجة مئوية.
  4. إضافة 2.75 ميكرولتر RT مزيج (2 ميكرولتر العازلة RT 5X ؛ 0.5 ميكرولتر 0.1M DTT ؛ 0.25 ميكرولتر مرتفع الثالث عكس المنتسخة [Invitrogen]).
  5. احتضان 5 دقائق عند 25 درجة مئوية و 20 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 دقيقة عند 50 درجة مئوية و 5 دقائق عند 80 درجة مئوية قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية.
  6. إضافة 90 ميكرولتر TE العازلة ، 0.5 و 10 ميكرولتر glycoblue خلات الصوديوم ميكرولتر الرقم الهيدروجيني 5.5 والمزيج. ثم يضاف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.
  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 6 ميكرولتر من المياه.
  2. إضافة 6 ميكرولتر 2X العازلة تحميل TBE - اليوريا (Invitrogen). عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 3 دقائق مباشرة قبل التحميل.
  3. تحميل العينات في جل الجاهزة TBE - اليوريا 6 ٪ (Invitrogen) وتشغيل لمدة 40 دقيقة عند 180 V كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. تحميل أيضا علامة منخفضة الوزن الجزيئي لقطع اللاحقة (أنظر أدناه).
  4. قطع ثلاثة نطاقات 120-200 في الإقليم الشمالي (عالية) ، 85-120 الإقليم الشمالي (وسط) والإقليم الشمالي 70-85 (منخفضة). استخدام صبغة theupper وعلامات على دعم هلام البلاستيك لتوجيه الختان (انظر الشكل 3). علما بأن التمهيدي Rclip وتسلسل حساب L3 معا لمدة 52 NT تسلسل CLIP.
  5. إضافة 400 TE ميكرولتر وسحق شريحة هلام الى قطع صغيرة باستخدام حقنة 1 مل المكبس. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. مكان اثنين من الزجاج 1 سم قبل المرشحات (Whatman ، 1823010) في عمود SpinX Costar (كورننغ إنكوربوريتد ، 8161). نقل الجزء السائل من العينة إلى العمود. تدور ل1 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في أنبوب مل 1.5.
  7. إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر و 40 ميكرولتر خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 ، ثم مزج العينة. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

12. ربط من التمهيدي إلى 5'end من [كدنا]

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 8 مزيج ربط ميكرولتر (6.5 ميكرولتر المياه ؛ 0.8 ميكرولتر 10X CircLigase الاحتياطي الثاني ؛ 0.4 ​​ميكرولتر 50 ملي MnCl 2 ؛ 0.3 ميكرولتر ؛ Circligase الثاني [Epicentre]) ، واحتضان ل 1 ح عند 60 درجة مئوية.
  2. افة 30 لتر للب لة (26 لتر المياه 3 الاحتياطي FastDigest لتر [Fermentas] 1 لتر cut_oligo [10 ]). احتضان لمدة 1 95 . انخفاض الحرارة ل 20 انية أقصاه 1 مئوية حتى 25 لت.
  3. افة 2 BamHI لتر (Fermentas السريع) لمدة 30 37 .
  4. TE 50 لتر glycoblue و 0,5 لتر المزيج. 10 ل لات الصوديوم الهيدروجيني 5,5 المزيج اف 250 لتر الإيثانول 100 ٪. ل ليلة -20 .
  1. باستمرار ل العينات (انظر 10.1) ، ثم remettre en suspension بيليه في 19 لتر المياه.
  2. PCR (19 لتر [كدنا] (1) التمهيدي لتر P5/P3 solexa ، 10 ك لكل منهما Accuprime 20 لتر Supermix 1 انزيم [Invitrogen]).
  3. ل البرنامج PCR التالية : 94 لمدة 2 [94 مئوية لمدة 15 انية و 65 مئوية لمدة 30 انية و 68 مئوية لمدة 30 ثانية] ات 25-35 68 ل 3 ائق 4 ات .
  4. المنتج 8 PCR لتر 2 لتر 5X TBE العازلة التحميل ل ل لام الجاهزة TBE 6 ٪ (Invitation). ار الجل مع Sybrgreen (Invitrogen) ليلها تصوير هلام.
  5. الباركود الاشعال Rclip السماح لعينات لفة متعددة ل لتسلسل اجية عالية. 15 لتر للمكتبة لترتيب .

14. ابط التمهيدي اليات

ل adénylé 3 'الحمض النووي رابط :

[نحن أجل المحول من الحمض النووي من IDT جعل من aliquotes 20μM.]

ل ابع iCLIP اح التجربة في خطوتين : الإشعاع الذاتي للمجمع البروتين RNA ل غشاء (الخطوة 8.5) لام المنتجات PCR (الخطوة 13.4). الإشعاع الذاتي العينات لياز لى النشاط الإشعاعي المنتشر الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 4). لالرفيع لياز العينات ا النشاط الإشعاعي لى الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 3). ا استخدام اعي الكشف أية إشارة (الشكل 2 ، وعينات 1 و 2). ابط هامة لخصوصية مناعي إما بحذف اشعة فوق البنفسجية أو استخدام الخلايا التي لا عن البروتين من الفائدة 14.

لام المنتجات PCR (الخطوة 13.4) الحجم الذي افق مع جزء [كدنا] (عالية أو متوسطة أو منخفضة) المنقى الخطوة 11.4 (الشكل 4 ، الممرات 4-6). لما الاشعال PCR P3Solexa P5Solexa ال افي 76 NT لحجم [كدنا]. ا لم استخدام الأجسام الاادة لال مناعي الكشف ات PCR المقابلة (الشكل 4 والممرات 1-3). التمهيدي المنتج الي 140 NT.

ل تحقيق النتائج ل الية الإنتاجية التسلسل والتحليلات اللاحقة انظر 14.


الشكل 1. ل لبروتوكول iCLIP. البروتينات الحمض النووي الريبي تساهميا المجمعات عبر ربط المجراة استخدام اشعة فوق البنفسجية (الخطوة 1). ا البروتين المصالح الحمض النووي الريبي ملزمة (الخطوات 2-5). للسماح لفتيلة لسل النسخ العكسي ، ligated ل RNA إلى 3 'نهاية الحمض النووي الريبي في حين 5' يسمى بالإشعاع نهاية (الخطوات 6 و 7). البروتين النووي الريبي ARN المجمعات مجانا باستخدام SDS - PAGE ل غشاء (الخطوة 8). استعاد الجيش الملكي النيبالي الغشاء بواسطة البروتين K ترك ببتيد المتبقية الارتباط النوكليوتيدات (الخطوة 9). النسخ العكسي (RT) اقتطاع المتبقية ل اليات الباركود (الخطوة 10). اار ل انا RT التمهيدي ل التعميم. الخطية التالية لد الب اسبة لتضخيم PCR (الخطوات 11-15). ا وارتفاع اجية لد التسلسل التي تليها مباشرة لسل النوكليوتيدات الباركود ل الأخير [كدنا] (الخطوة 16). ا الموقف النوكليوتيدات un المنبع من النوكليوتيدات ، استخلاصه الموقع ملزم دقة عالية.


الشكل 2. الإشعاع الذاتي مجمعات C - ARN hnRNP استخدام هلام إستشراد ونقل الغشاء. hnRNP C - ARN ان يهضم جزئيا استخدام الحمض النووي الريبي (+) الية (+ +) لياز. لاحظة ل المجمعات ا حجم البروتين (40 لو دالتون) (نموذج 4). ا التحول ل ا ا استخدمت ات الية لياز (نموذج 3). ارة المشعة عندما استخدام في مناعي (عينات 1 و 2).


الشكل 3. 6 ٪ TBE - اليوريا هلام (Invitrogen) للاسترشاد ا استئصال المنتجات iCLIP [كدنا]. ل الجل لمدة 40 دقيقة عند 180 V ا إلى الهجرة استنساخه من ADNc والأصباغ (الضوء والظلام الأزرق) في هلام. استخدام لاقة لقطع (خط أحمر) ارتفاع (H) ، متوسطة (M) ومنخفضة (L) الكسور [كدنا]. اللون الأزرق الفاتح لى الفور لامة على الكاسيت لام البلاستيك. ليم الكسر العالية حوالي 1 اللون الأزرق الفاتح. اام تخفيضات العمودي تسترشد الجيوب لفصل المسارات المختلفة (في هذا المثال 1-4). لطخة الممر علامة (م) لمراقبةبعد أحجام القطع. ار لى ام لى اليمين.


الشكل 4. ليل PCR - ات iCLIP [كدنا] استخدام لام إستشراد. ااد الجيش الملكي النيبالي اء (الشكل 1) المنقى التي الكهربائي للهلام (الشكل 2). حجم ثلاثة من [كدنا] (عالية [H] : 120-200 الإقليم الشمالي والمتوسطة [M] : 85-120 NT [L] : 70-85 NT) لاحظة المنتجات PCR لفة الحجم لأحجام مختلفة الإدخال. التمهيدي PCR 76 NT لى [كدنا] ام اوح ا 196-276 NT الية 161-196 الإقليم الشمالي للمتوسط ​​​​و 146-161 الإقليم الشمالي للكسور حجم لل ات PCR ائبة ا استخدام لمناعي (الممرات 1-3).

Discussion

ل iCLIP لى التفاعلات الإنزيمية والخطوات لتنقية ليس السهل دائما تحديد المشكلة عند تجربة فشل. ل السيطرة لى لخصوصية المواقع الارتباط ARN الضوابط العينة الأضداد الخلايا عبر ربط مناعي الخلايا الأنسجة خروج المغلوب. الناحية المثالية أن التجارب لا مجمعات البروتين ARN وبالتالي ينبغي إشارة على جل SDS - PAGE وليس بعد ات اف ل الية الإنتاجية لسل المكتبات التحكم تسلسل فريد قليلة جدا. .

ا الاحتياطات الواجب اتخاذها لتجنب لوث المنتجات PCR التجارب السابقة. PCR. الناحية المثالية اء ليل PCR المنتجات الخطوات اللاحقة غرفة منفصلة. لاوة لى لك لى كل المختبر استخدام الخاصة ا المخازن والكواشف الأخرى. الطريقة ادر التلوث أسهل.

Divulgations

الإعلان ارب المصالح.

Remerciements

الكتاب أعضاء المختبرات الندبة Luscombe Zupan للمناقشة المساعدة التجريبية. ادفيلد اثيوز التسلسل الإنتاجية العالية. لى الأسلوب الموصوفة هنا iCLIP خطوات مع بروتوكول CLIP الأصلي الذي و JU روبرت دارنيل. هذا العمل عن المجلس الأوروبي للبحوث 206726 - CLIP لJU والطويلة الأجل للعلوم الإنسان حدود الزمالة لبرنامج JK

Matériaux

Nom Société Numéro de catalogue commentaires
Pour l'électrophorèse sur gel et le transfert sur membrane, nous recommandons l'utilisation du kit de module XCell SureLock™ Mini-Cell et XCell II™ Blot Marquage CE (Invitrogen, EI0002), qui est compatible avec l'utilisation des différents minigels préfabriqués spécifiés tout au long le protocole. La marque et le numéro de commande de tous les matériaux utilisés sont mentionnés lors du protocole. La liste des enzymes utilisées dans le protocole est présentée dans le tableau ci-dessous.
Dynabeads de protéine A Invitrogène 10001D utiliser la protéine G pour les anticorps de souris ou de chèvre
RNase I Ambion AM2295 l'activité peut changer d'un lot à l'autre
T4 ARN ligase I Biolabs de la Nouvelle-Angleterre M0204S
PNK Biolabs de la Nouvelle-Angleterre M0201S
protéinase K Groupe Roche 03115828001
Transcriptase inverse exposant III Invitrogène 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentations FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogène 12342010 ce mélange PCR donne les meilleurs résultats entre nos mains

Les références

  1. Keene, J. D. Régulons ARN : coordination des événements post-transcriptionnels.Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
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  6. Mili, S., Steitz, J. A. Preuve de la réassociation des protéines de liaison à l'ARN après la lyse cellulaire: implications pour l'interprétation des analyses d'immunoprécipitation.ARN. 10, 1692-1694 (2004).
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Erratum

Correction formelle : Erratum : iCLIP - Cartographie à l'échelle du transcriptome des interactions protéine-ARN avec résolution individuelle des nucléotides
Publié par JoVE Editors le 14/07/2011. Lien citable.

Une correction a été apportée à iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Il y a eu une erreur dans la partie 2 de l'étape 3. L'un des caractères avait le symbole incorrect et a été corrigé en :