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Préparation PCR Mastermix

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Je prépare actuellement un mastermix PCR pour la première fois, et j'ai quelques questions concernant la distribution. J'essaie d'amplifier un groupe de gènes spécifique dans un échantillon d'ADN afin de pouvoir l'utiliser dans un vecteur de clonage ; cependant, je ne sais pas combien de mélanges réactionnels PCR séparés je dois préparer dans mon mastermix à cette fin ? Aussi, quel est le but d'un mélange de réaction PCR négatif (sans l'ADN matrice), car j'ai vu une procédure recommander d'en faire un. Dois-je préparer le même nombre de réactions négatives que positives, ou dois-je n'en préparer qu'une ?


Un Master Mix PCR n'est qu'un moyen d'accélérer votre pipetage. Au lieu de préparer 10 réactions différentes de 20 ul chacune (par exemple), vous préparez une réaction de 200 ul puis vous la divisez en 10 tubes. Cela réduit également les erreurs de distraction (il est moins probable d'oublier de pipeter une fois 100 ul que 20 fois 5 ul). De plus, moins de plastique (embouts de pipettes) est utilisé.

Quelques conseils:

Compte tenu de l'erreur de certaines pipettes, il est généralement bon de compter pour une réaction supplémentaire toutes les 10. Par exemple, si vous devez exécuter 10 PCR, faites un Master Mix pour 11.

Si vous prévoyez d'exécuter le même PCR sur différents modèles (ce qui est souvent le cas), vous n'avez pas besoin d'ajouter le modèle dans votre mix.

Les contrôles négatifs et positifs doivent toujours être inclus.

Le contrôle négatif d'une réaction PCR est souvent effectué en remplaçant l'ADN matrice par de l'eau. Le contrôle négatif ne doit présenter aucune bande d'amplification. Cela garantit que vous n'avez pas de contaminants d'ADN dans votre mélange et que vos amorces ne s'amplifient pas les unes les autres.

Un contrôle positif est une réaction qui devrait fonctionner. Dans ce cas, si votre contrôle positif montre une amplification mais pas votre échantillon, vous savez que ce n'est pas à cause d'un composant de la réaction qui se comporte de manière inattendue (polymérase, tampon, etc…).

Faisons un exemple pratique.

Disons que je veux amplifier la même séquence cible à partir de 10 échantillons d'ADN différents.

La réaction 1X ressemble à quelque chose comme :

**PCR 1X** Gabarit 1ul Primer F 1ul Primer R 1ul H2O 10ul MgCl2 2ul dNTPs 2ul Tampon 10X 2ul Polymérase 1ul

Maintenant, compte tenu des contrôles positifs et négatifs et de 10 % de volume supplémentaire, je préparerais un Master Mix pour 13 réactions. Bien sûr, le modèle doit être exclu.

**Master Mix 13X:** Primer F 13ul Primer R 13ul H2O 130ul MgCl2 26ul dNTPs 26ul Tampon 10X 26ul Polymerase 13ul

Maintenant, aliquotez 19 ul dans les 12 tubes, ajoutez 1 ul du bon modèle à chacun d'eux (dans le C- ajoutez simplement 1 ul H2O) et lancez-le !

Dans certains cas, vous souhaiterez peut-être amplifier différentes séquences cibles à partir du même ADN. Dans ce scénario, vous souhaitez inclure le modèle dans le Master Mix, car il est le même pour toutes les réactions, mais vous souhaitez ajouter les amorces séparément car chaque réaction contiendra un ensemble spécifique d'amorces pour amplifier une séquence spécifique.


Il y a quatre choses que vous pouvez changer en fonction de la quantité d'ADN que vous devez insérer dans le vecteur de clonage :

  • (i) quantité de mélanges de réaction PCR ("combien de tubes")
  • (ii) concentration d'ADN matrice ("combien d'ADN matrice dans un tube")
  • (iii) combien de cycles ("combien de fois allez-vous amplifier votre modèle")
  • (iv) à quel point l'amplification est-elle efficace (« à quel point l'amplification est-elle efficace »), c'est-à-dire que, idéalement, chaque cycle double exactement votre ADN, mais en pratique, c'est presque double ou parfois sensiblement inférieur au double

Rappelez-vous, 1 tube après 10 cycles contient idéalement exactement autant d'ADN que 2 tubes après 9 cycles. Habituellement, changer le nombre de cycles est la voie à suivre. Vous n'avez pas besoin d'autant d'ADN pour l'insertion du vecteur, j'irais avec un seul tube pour commencer.

De combien d'ADN ai-je besoin ?

Nous ne pouvons pas vous aider à déterminer la quantité dont vous avez besoin, mais voyez de quelle quantité vous avez besoin pour l'insertion dans le vecteur ; faites un excès par PCR, vérifiez si la PCR a fonctionné sur un gel (purification de taille) et mesurez la concentration de votre produit. Ensuite, vous prenez la quantité appropriée pour faire votre vecteur.

Contrôle PCR négatif ?

Le contrôle négatif est une réaction de contrôle qui contient tous les composants essentiels de la réaction d'amplification à l'exception de la matrice. Cela permet de détecter une contamination due à des réactifs contaminés ou à de l'ADN étranger. Ici, vous ne devriez voir exactement aucun produit PCR - si vous le faites, vous devrez dépanner vos réactifs !

Combien de mélanges réactionnels PCR séparés dois-je préparer ?

Si vous ne faites qu'amplifier l'ADN, un tube devrait suffire pour voir des bandes claires sur un gel. Dans d'autres cas, par exemple avec la PCR quantitative (ce que vous ne faites pas), vous prépareriez des réplicats, vous avez donc un tube négatif, et disons 3 tubes expérimentaux (réplicats techniques) afin que vous puissiez les moyenner pour une meilleure précision et fiabilité.

Lors de la préparation d'un master mix, par ex. pour 10 réactions, préparez-le comme si vous faisiez 10 % de réactions en plus (11 réactions) afin de pouvoir tout pipeter confortablement. Vous avez besoin de 100 ml de solution pour une expérience ? Faire 110mL. Il s'agit d'une bonne pratique générale en laboratoire - faites toujours un léger excès de master mix.


Le nombre de réactions que vous configurez dépend de nombreux paramètres. Pour répondre à cette question, vous auriez besoin de détails sur la source de l'ADN matrice, le point de fusion des amorces, la taq que vous utilisez et la taille du produit que vous souhaitez amplifier. Tous ces éléments dicteront la façon dont vous optimiserez votre PCR. Jetez un œil à la référence ci-dessous http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/4/pdb.ip66.abstract


Qu'est-ce qu'un Master Mix PCR ?

Un master mix PCR est une solution prémélangée qui contient la plupart des composants nécessaires à l'exécution d'un test PCR. Le mélange contient de l'ADN polymérase Taq, des dNTP, du MgCl2, ainsi que des activateurs et des stabilisants dans un tampon optimisé pour l'amplification d'ADN par PCR.

Avantages de l'utilisation d'un Master Mix PCR

Le principal attrait de l'utilisation d'un master mix PCR est sa commodité. La plupart des composants ont déjà été ajoutés et la formule a déjà été optimisée, réduisant ainsi considérablement le temps de préparation du pré-dosage.

L'utilisation de mélanges PCR maîtres garantit également un degré élevé de cohérence, même dans des environnements d'analyse à volume élevé, et le nombre réduit d'étapes de pipetage impliquées signifie également moins de risques de contamination. L'utilisation d'un master mix PCR réduit également le risque d'erreur de préparation, comme l'omission accidentelle d'un composant.

De plus, les mélanges principaux commerciaux peuvent contenir divers activateurs et stabilisants qui ne sont pas familiers aux utilisateurs novices de PCR. Ils sont également soumis à des procédures de contrôle de la qualité et à des analyses qui produisent un produit extrêmement précis et fiable. Ces facteurs se traduisent par une amélioration globale des performances de dosage.

Tous ces avantages sont particulièrement importants à prendre en compte pour les utilisateurs novices en PCR.

Qu'est-ce que j'ajoute à un Master Mix PCR ?

Format Master Mix et stabilité de l'ampli

Les master mix PCR existent généralement sous deux formats principaux. Le plus souvent, les master mix PCR se présentent sous forme liquide. Les master mix PCR liquides nécessitent généralement des conditions de stockage entre -20 °C – ­­4 °C et ont tendance à être moins chers que les mélanges lyophilisés. Ils sont décongelés avant utilisation dans un test PCR.

Les master mix PCR peuvent également se présenter sous un format lyophilisé ou lyophilisé. Cela permet au mélange d'être expédié à température ambiante. Certains master mix lyophilisés peuvent également être conservés à température ambiante à long terme. Le master mix est ensuite reconstitué avec la solution tampon d'accompagnement avant utilisation.

Mélanges principaux de PCR de routine

Les mélanges maîtres utilisés pour les tests PCR de routine amplifient généralement les séquences cibles d'une taille allant jusqu'à 5 kb, avec une teneur en GC comprise entre 40 % et 60 %.

Divers mélanges maîtres existent également pour les dosages souhaitant un niveau amélioré de performances PCR :

  • Hot Start Taq : prévention de l'amplification non spécifique à basse température
  • Taq Haute-Fidélité : enzymes spécialisées pour les amplicons à longue portée, jusqu'à 20 kb

Master Mix PCR en temps réel

Les mélanges maîtres créés pour être utilisés avec les tests PCR en temps réel sont optimisés pour les tests utilisant une chimie de détection de colorant ou de sonde.

Les mélanges principaux de PCR utilisés dans les tests utilisant la chimie de détection de colorant peuvent ou non contenir le colorant de liaison à l'ADN double brin réel. Si le colorant n'est pas inclus, l'utilisateur peut ajouter un colorant externe personnalisé au mélange principal.

De même, les master mix PCR conçus pour les dosages utilisant la chimie de détection de sonde n'incluent pas la sonde marquée au fluorophore dans le mélange, mais elle peut être ajoutée par l'utilisateur.

Les master mix PCR destinés aux dosages utilisant l'un ou l'autre type de chimie de détection peuvent également inclure un colorant de référence passif le plus couramment inclus est le ROX. Ce colorant de référence est nécessaire au fonctionnement de certains instruments de PCR en temps réel, mais pas tous. Il convient de déterminer si votre instrument nécessite ce colorant de référence avant de choisir un master mix PCR en temps réel.

Dois-je jamais utiliser un Master Mix PCR maison ?

Dans la plupart des cas, les avantages de l'utilisation d'un master mix PCR sont bien supérieurs aux avantages qui peuvent être retirés de la création d'une solution de master mix PCR personnalisée.

Cependant, pour les tests nécessitant un niveau accru de contrôle de l'utilisateur sur les conditions expérimentales, les mélanges maîtres PCR préparés à la maison peuvent être le meilleur choix. Les applications en aval exigeant ce niveau de contrôle de l'utilisateur sur les spécifications du test peuvent inclure le séquençage, le clonage, etc.

Ces master mix PCR maison sont également souvent proposés à un prix réduit. Néanmoins, l'optimisation du tampon doit être effectuée par l'utilisateur, ce qui implique un investissement de temps supplémentaire.


Préparer un master mix

Voici le protocole de base pour la mise en place d'une expérience PCR :

Tout d'abord, tous les ingrédients, à l'exception des matrices d'ADN, sont combinés dans un mélange principal (aussi appelé cocktail). Le mélange maître est pipeté dans les tubes PCR individuels, et enfin une matrice d'ADN différente est ajoutée à chaque tube. Dans cet exemple, il y a quatre tubes PCR qui devraient normalement inclure deux PCR expérimentales et un contrôle positif et un contrôle négatif.


Méthodes  

Le master mix PCR a été préparé en incluant les composants suivants (par réaction) : SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2X Premix), 25 µl M13 Primer M4 (20 µM), 0,5 µl M13 Primer RV (20 µM), 0,5 µl dH2O, 24 µl. Des aliquotes de master mix PCR (50 µl) ont été distribuées dans chaque tube PCR. Une pointe de micropipette stérile a été utilisée pour transférer quelques cellules de chaque colonie dans un tube PCR correspondant, où les cellules ont été remises en suspension dans un master mix PCR. La PCR a été réalisée à l'aide d'un thermocycleur Takara PCR Thermal Cycler Dice (non disponible dans toutes les zones géographiques). Les conditions de cyclage étaient : 94°C, 1 min suivi de 30 cycles de 98°C, 5 sec 55°C, 5 sec et 72°C, 40 sec. Une fois la PCR terminée, 5 µl de chaque réaction ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose L03 à 1 %.


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Pfu ADN polymérase MasterMix [2X] (1 citations)

Pfu DNA Polymerase Mastermix [2X] est une solution prémélangée et prête à l'emploi contenant de la Pfu DNA Polymerase, des dNTP, du MgSO4 et un tampon de réaction à des concentrations optimales pour une amplification efficace des matrices d'ADN par PCR. Pour préparer la PCR finale, seuls les amorces et l'ADN matrice sont ajoutés. Pfu Mix contribue à une PCR hautement reproductible en réduisant le risque d'erreurs de pipetage, d'erreurs de calcul et de contamination.


L'ADN polymérase Pfu, dérivée de l'archae hyperthermophile Pyrococcus furiosus, s'est avérée présenter des propriétés de thermostabilité et de relecture supérieures par rapport aux autres polymérases. Contrairement à la Taq polymérase, l'ADN polymérase Pfu hautement thermostable possède une activité de relecture des exonucléases 3 & 39 qui permet à la polymérase de corriger les erreurs d'incorporation de nucléotides. Cela signifie que les fragments PCR générés par l'ADN polymérase Pfu auront moins d'erreurs que les inserts PCR générés par Taq. L'utilisation de l'ADN polymérase Pfu dans vos réactions PCR permet d'obtenir des produits PCR à extrémités franches, qui sont idéaux pour le clonage dans des vecteurs à extrémités franches. Utilisez la polymérase Pfu pour les techniques qui nécessitent une synthèse d'ADN haute fidélité.

DÉFINITION DE L'UNITÉ
Une unité (U) de Pfu polymérase est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour catalyser l'incorporation de 10 nanomoles de désoxyribonucléotides dans un matériau insoluble dans l'acide en 30 minutes à 70°C en utilisant l'ADN de sperme de hareng comme substrat.

COMPOSITION DU MÉLANGE Pfu
L'ADN polymérase Pfu est fournie dans un tampon 2X Pfu, dNTP, 3 mM MgSO4 et le bleu de bromophénol. Le tampon de mélange Pfu est une formulation exclusive optimisée pour des performances robustes en PCR.


NZYTaq II 2x Green Master Mix ( MB358)

La description: NZYTaq II 2× Green Master Mix est une solution prémélangée prête à l'emploi contenant de l'ADN polymérase NZYTaq II (MB354), qui appartient à une nouvelle génération de Taq-dérivé d'ADN polymérases optimisées pour les applications PCR standard. Le master mix contient des dNTP, un tampon de réaction et des additifs à des concentrations optimales et prend en charge l'amplification robuste et fiable d'une large gamme de matrices d'ADN jusqu'à 6 kb. MgCl2 la concentration finale est de 2,5 mM, permettant la mise en œuvre d'une gamme complète de protocoles PCR. De plus, les réactions assemblées avec NZYTaq II 2× Green Master Mix peuvent être directement chargées sur des gels d'agarose. Le mélange contient deux colorants (bleu et jaune) qui permettent de suivre l'avancement de l'électrophorèse.

Les produits PCR résultants ont un surplomb A et sont adaptés au clonage avec le kit de clonage PCR NZY-A de NZYTech (MB053) ou le kit de clonage PCR Speedy NZY-A (MB137).

Caractéristiques:
– Master mix PCR pratique et prêt à l'emploi
– Chargement direct du gel
– Des rendements élevés avec une optimisation minimale
– Amplification robuste utilisant une large gamme de modèles d'ADN
– Laisse un porte-à-faux A

Applications:
– Puissante PCR
– Colonie PCR
– Génération de produits pour le clonage TA

Caractéristiques:

Longueur du produit : 0-6 ko
Capacité de type démarrage à chaud : non
Temps de prolongation : 15-30 sec/kb à 72 °C
Activité 3´→5´ : non
Surplomb du produit : 3'-A
Conditions de stockage: Conserver à -20 ºC
Conditions de livraison : Expédié à température ambiante sur glace sèche

Composants:
NZYTaq II 2× Green Master Mix (0,2 U/μL)

1. Que faire en l'absence d'amplification du produit ou de faible rendement ?
Cela peut être dû aux situations suivantes :
a) Température de recuit inadéquate . La composition du mélange réactionnel peut affecter les propriétés de fusion des amorces et de l'ADN. Ajuster la température de recuit pour accueillir l'apprêt avec la température de fusion la plus basse (5 °C à 10 °C inférieure à Tm).
b) Présence d'inhibiteurs de PCR . Certaines procédures d'isolement d'ADN, en particulier l'isolement d'ADN génomique, peuvent entraîner la co-purification des inhibiteurs de PCR. Réduire le volume d'ADN matrice dans la réaction ou diluer l'ADN matrice avant de l'ajouter à la réaction. La dilution d'échantillons même au 1:10 000 s'est avérée efficace pour améliorer les résultats, en fonction de la concentration initiale d'ADN.
c) La concentration de magnésium est trop faible. Mg 2+ est inclus dans le Master Mix à une concentration finale de 2,5 mM, ce qui est suffisant pour la plupart des cibles. Pour certaines cibles, une concentration plus élevée en Mg 2+ peut être requise. Titrer de 2,5 mM à 4 mM (concentration finale) par incréments de 0,5 mM. (Remarque : MgCl2 n'est pas fourni dans des tubes séparés).

2. Comment puis-je réduire le nombre de bandes non spécifiques ?
Ajustez les conditions d'hybridation et/ou concevez un autre jeu d'amorces, en augmentant la longueur et en évitant les séquences complémentaires.

3. Comment dois-je conserver mon NZYTaq II 2× Green Master Mix ?
Le produit doit être conservé à -20 ºC, dans un congélateur à température constante.

Analyse comparative préliminaire du pouvoir de résolution de COX1 et
16S-rDNA comme marqueurs moléculaires pour l'identification des tiques du Portugal

Filipe D, Parreira R, Pereira A, Galvão N, Cristovão MJ, Nunes M, Vieira LM, Campino L, Maia, C
Parasitologie vétérinaire : études et rapports régionaux , 2021

Diversité structurelle des populations photoautotrophes au sein du site de l'UNESCO « Vieille cathédrale de Coimbra » (Portugal), en utilisant une approche combinée
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Diversité et distribution fongiques à travers des phénomènes de biodétérioration distincts dans les murs de calcaire de l'ancienne cathédrale de Coimbra, site du patrimoine mondial de l'UNESCO
Trovão J, Portugal A, Soares F, Paiva DS, Mesquita N, Coelho C, Pinheiro AC, Catarino L, Gil F, Tiago I
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    Mélange d'enzymes eLONGase (GibcoBRL Life Technologies n° de catalogue 10480-028)
    dNTP (Roche Molecular Biochemicals, 1051466, 1051458, 1051440, 1051482) - 4 mM
    Amorces oligonucléotidiques directe/inverse - 7µM = 100 ng/µL d'amorce 40-mer avec 5' à queue
    extension universelle (voir DNA Analysis Protocols Manual - PCR Primer Selection/Design) (GibcoBRL Life Technologies)

I. Configuration à réaction unique

    Le volume total pour une seule réaction PCR est de 10 µL. Tableau 1 liste les réactifs
    pour une réaction et les concentrations initiale et finale.

    Tableau 1. Concentrations et volumes de réactifs pour une seule réaction PCR
    Réactif[Conc. Initiale][Conc. finale]Volume (µL)
    Tampon eLONGase A10X0.5X1
    Tampon eLONGase B10X0.5X1
    jjH2010X0.5X1
    DNTP4 mm100 µM0.25
    eLONGasetaq1 U/µL0,4 U/µL0.4
    Apprêt 17 µM140 nM0.2
    Apprêt 27 µM140 nM0.2
    ADN5 µM2 ng/µL4
    Volume total10

II. Configuration du réactif eLONGase MasterMix

  1. Le eLONGase MasterMix est aliquoté dans deux colonnes d'une plaque PCR jupée à 96 puits.
  2. Un volume de 7 fois (39,2 L/puits) de MasterMix est placé dans les colonnes 1 et 7 de la plaque prête pour la PCR.
  3. Nous ajoutons une réaction supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage dans les colonnes.
      Noter: La configuration du réactif est spécifique à notre configuration de bloc PGA DNA Panel (voir DNA Panel), qui consiste en un bloc de puits profonds au format 96 contenant 48 échantillons d'ADN dupliqués de chaque côté du bloc, colonnes 1-6 et 7-12, respectivement (voir la figure 1).

III. Recette du Master Mix eLongase

  1. Pour faciliter l'aliquotage sur la plaque prête pour la PCR, un grand MasterMix voume (volume de plaque 12x96 ou plus) peut être installé dans une plaque profonde à 96 puits et transféré à l'aide d'une pipette multicanaux (ou d'un robot) vers la plaque PCR-ready plaque (voir dernière colonne, Tableau 2, au dessous de).
    Tableau 2.eLONGase MasterMix Concentration et Volumes
    Réactif[Conc. Initiale][Conc. finale]Volume (µL)
    1x96 plaque
    (2 colonnes)
    Volume (µL)
    12x96 assiettes
    (24 colonnes)
    Tampon eLONGase A5X0.5X14168.0
    Tampon eLONGase B5X0.5X14168.0
    jjH201 FOIS1 FOIS41.3495.6
    dNTP4 µM100 µM5.642.0
    eLONGase Taq1 U/µL0,04 µL0.2567.2
    Volume total78.4940.8
    Noter: Tous les ajouts se font dans un seul puits dans une colonne de la plaque 96 puits profonde, sauf indication contraire.

IV. Préparation d'Elongase MasterMix à aliquoter

  1. Décongeler les tampons Elongase A et B et les ddNTP. Après décongélation, bien vortexer.
  2. Conservez l'enzyme Elongase au congélateur jusqu'à ce que vous en ayez besoin.
  3. Ajouter 495,6 L - ddH2O
  4. Ajouter 168 L - Tampon Elongase A
  5. Ajouter 168 L - Tampon Elongase B
  6. Ajouter 42 L - dNTP
  7. Retirer l'enzyme Elongase du congélateur
  8. Ajouter 67,2 L - Enzyme élongase
  9. Lentement mélanger MasterMix 30 fois dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux de 20 à 200 L (réglage = 15 L).
  10. Centrifuger le bloc de 96 puits profond sur le réglage basse vitesse (Centrifugeuse Jouan : 190 x g pendant 20 sec, Programme 1 (1000 tr/min pendant 20 sec>.

V. Préparation de plaques 96 puits à jupe prêtes pour PCR

  1. Tracez une ligne entre les colonnes 6 et 7 pour indiquer les deux moitiés de la plaque à 96 puits jupée.
  2. Encerclez le puits dans la ligne Q et la colonne 1 (dans le coin supérieur gauche) pour l'orientation.
  3. Une aliquote de 39.w L forme chaque puits de la plaque à 96 puits profonde aux colonnes 1 et 7 d'une plaque à jupe à 96 puits prête pour la PCR à l'aide d'une pipette multicanaux 20-200.
  4. Placer chaque assiette finie sur de la glace.
  5. Étiquetez la feuille d'étanchéité en aluminium avec la date actuelle et MASTERMIX PRÊT POUR LA PCR.
  6. Sceller chaque assiette avec du papier d'aluminium et la dentelle au congélateur à -20 C.

VI. Configuration d'amplification compatible PCR

Par la main:

Ces instructions décrivent la configuration d'une plaque. Deux jeux d'amorces peuvent être amplifiés sur une plaque, un dans les colonnes 1 à 6 (appelé ci-dessous jeu d'amorces #1) et un autre dans les colonnes 7 à 12 (appelé ci-dessous jeu d'amorces #2). Plusieurs assiettes peuvent être installées à la fois, gardant toutes les assiettes sur la glace lorsqu'elles ne sont pas utilisées.


Voir la vidéo: Setting up the PCR reaction (Mai 2022).