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Utiliser une proportion ou un indice de diversité lorsqu'il s'agit de seulement deux souches

Utiliser une proportion ou un indice de diversité lorsqu'il s'agit de seulement deux souches


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J'étudie le maintien de la diversité dans un système expérimental composé de seulement deux souches. J'ai des données de comptage. Je peux calculer leurs proportions et je peux utiliser ces données dans mes modèles statistiques, ou je peux calculer la diversité de Shannon ou de Simpson, et utiliser ces données.

Ma question est la suivante : lorsqu'il s'agit de ne traiter que deux souches, est-il vraiment nécessaire d'utiliser un indice de diversité calculé, ou les proportions feront-elles l'affaire ?

L'avantage de l'utilisation des proportions est qu'il s'agit d'une métrique plus accessible - ne nécessitant aucune connaissance (bien qu'assez basique) des indices de diversité et de la façon dont ils modifient les données.

Après avoir calculé Shannon, Simpson et les proportions, et passé les trois à travers mes modèles, cela ne fait aucune différence que j'utilise - les données sont assez emphatiques. Mon instinct un peu instruit est, dans ce cas, d'utiliser la métrique la plus simple, mais je recherche des avis sur le cas.


Étendu sur la statistique suggérée

La proportion $p$ n'est certainement pas une bonne mesure de la diversité. Une proportion de 0 ou 1 indique l'absence de diversité d'espèces car il n'existe qu'une seule espèce. Si une espèce n'atteint jamais une fréquence de 0,5 dans vos données, cela peut être raisonnable cependant. Sinon, quelque chose comme $p(1-p)$ pourrait être une statistique intéressante.

Si vous êtes prêt à utiliser $2p(1-p)$ (au lieu de $p(1-p)$ ci-dessus) comme indice de diversité, alors vous pouvez faire remarquer qu'il peut être facilement étendu à $S$ espèces avec $1-sum_{s=1}^S p_s^2$, où $p_s$ est la fréquence de l'espèce $s$ par analogie avec la diversité génétique au sein des populations (voir Nei 1973).

Notez que ces statistiques seront sensibles à la taille de l'échantillon. Par exemple, si vous n'avez échantillonné qu'un seul individu, alors cet individu ne peut appartenir qu'à une seule espèce et votre mesure de diversité ne peut être que de zéro. Vous voudrez peut-être calculer un estimateur sans biais pour cette statistique.

Votre objectif est de réduire la charge cognitive du lecteur

Votre objectif est d'utiliser une statistique qui communiquera facilement. Si vos lecteurs sont très habitués aux indices de Simpson ou de Shannon, alors même un indice mathématiquement plus simple pourrait finir par entraîner une charge cognitive supplémentaire pour le lecteur.

OMI, il sera difficile de donner une réponse plus précise sans savoir 1) qui seront vos lecteurs (dans quelle revue envisagez-vous de publier) et 2) quelles sont la manipulation et l'interprétation exactes des données que vous visez à faire en fonction sur vos résultats. Par exemple, si cela facilite les comparaisons entre les graphiques en utilisant une statistique plus simple plutôt qu'une fois plus compliquée, alors choisir la statistique la plus simple est une bonne idée.

Bonne analyse statistique

Dans tous les cas, il est essentiel que vous essayiez (et vous l'avez fait) différentes mesures de la diversité des espèces et assurez-vous que votre conclusion est robuste à ces différentes mesures et expliquez dans vos méthodes que la statistique choisie n'aura pas d'importance. Cela renforcera votre argument et votre choix de statistique.


Génomique comparative des génomes core et accessoires de 48 Sinorhizobiumsouches comprenant cinq génoespèces

Les sinorhizobia sont parmi les membres les mieux étudiés des bactéries nodulaires racinaires fixatrices d'azote et contribuent des quantités substantielles d'azote fixé à la biosphère. Alors que le symbiote de la luzerne Sinorhizobium meliloti RM 1021 a été l'une des premières souches rhizobiennes à être complètement séquencée, peu d'informations sont disponibles sur les génomes de ce groupe d'espèces vaste et diversifié.

Résultats

Nous rapportons ici le projet d'assemblage et d'annotation de 48 souches de Sinorhizobium comprenant cinq génoespèces. Tandis que S. meliloti et S. medicae sont taxonomiquement apparentés, ils présentent différents schémas de nodulation sur divers Medicago plantes hôtes, et ont des différences dans la teneur en gènes, y compris ceux impliqués dans la conjugaison et l'utilisation du soufre organique. Les gènes impliqués dans la biosynthèse du facteur Nod et des polysaccharides, la dénitrification et les systèmes de sécrétion de type III, IV et VI varient également au sein des espèces et entre elles. Le phénotypage symbiotique et les analyses mutationnelles ont indiqué que certains gènes de sécrétion de type IV sont liés à la symbiose et impliqués dans l'efficacité de la fixation de l'azote. De plus, il existe une corrélation entre la présence de systèmes de sécrétion de type IV, de gènes de biosynthèse de l'hème et de dénitrification microaérobie, et l'efficacité symbiotique.

Conclusion

Nos résultats suggèrent que chaque Sinorhizobium utilise une stratégie légèrement différente pour obtenir une compatibilité maximale avec une plante hôte. Ce vaste ensemble de données génomiques fournit des informations utiles pour mieux comprendre les caractéristiques fonctionnelles de cinq Sinorhizobium espèces, en particulier la compatibilité dans les légumineuses-Sinorhizobium interactions. La diversité des gènes présents dans les génomes accessoires des membres de ce genre indique que chaque bactérie a adopté des stratégies légèrement différentes pour interagir avec divers genres végétaux et environnements du sol.


Biologie des systèmes

La biologie des systèmes postule qu'un organisme est plus que la somme de ses parties, c'est-à-dire que les propriétés émergentes qui constituent les caractéristiques physiques d'un organisme ne peuvent pas être expliquées par un examen de tous les composants individuels qui constituent l'organisme. L'étude des organismes d'une manière holistique n'est pas nouvelle comme le soulignent Kahlem et Birney (Kahlem et Birney 2006), c'était la seule façon d'étudier les organismes jusqu'à relativement récemment. Au 19 e siècle, les scientifiques ont commencé à démonter des organismes au niveau moléculaire pour étudier leurs composants. Au fur et à mesure que le dogme central de la biologie était élucidé, des méthodes de plus en plus sophistiquées pour étudier la biologie moléculaire ont été développées et dans la seconde moitié du 20 e siècle, la biologie moléculaire a dominé de nombreux domaines de la biologie. Avec l'avènement de la révolution génomique, il est devenu possible d'assembler une liste complète des gènes et des produits géniques d'un organisme - essentiellement une liste de pièces. Le développement ultérieur d'autres approches omiques nous a permis de recueillir des données supplémentaires à partir d'expériences conçues pour détecter si et dans quelles conditions les composants apparaissent dans un organisme. Le résultat a été un nombre presque écrasant de données. Au cours des 10 dernières années, il a commencé à être plus largement reconnu que le paradigme de la biologie des systèmes offre un moyen d'extraire un sens de ces données et d'aller au-delà de la simple apprivoisement des données pour les utiliser pour construire des vues complètes d'un organisme, des modèles qui peut avoir un énorme pouvoir explicatif.

La biologie des systèmes, en tant que façon de penser et d'explorer la biologie, trouve ses racines dans les travaux de Ludwig von Bertalanffy sur la théorie des systèmes (Bertalanffy 1969) et les travaux de Norbert Weiner sur la cybernétique (Wiener 1948). Après la publication de ces travaux, les biologistes ont commencé à appliquer la « pensée systémique » à la biologie et ont cherché à découvrir les lois fondamentales régissant l'évolution et le comportement, ou au moins à formaliser ce qui étaient (et sont) les explications intuitives des phénomènes biologiques (par exemple, une revue, voir Wolkenhauer 2001). La construction de modèles est au cœur de la biologie des systèmes. Les premiers succès de la modélisation de la biologie des systèmes étaient centrés sur la biochimie du métabolisme, avec des techniques de modélisation développées dans le cadre de la théorie du contrôle métabolique (Heinrich et Schuster 1996) et de la théorie des systèmes biologiques (Voit 2000). Cependant, le plein développement de la biologie des systèmes a été entravé par un manque de données. Par conséquent, les génomes et les masses de données associées générées par les méthodes à haut débit qui ont commencé à apparaître dans les années 1990 représentaient une opportunité. Si elles sont intégrées avec soin, ces données peuvent être utilisées pour construire un modèle qui représente une compréhension au niveau du système d'un élément donné de la machinerie cellulaire, ou d'une cellule, ou d'un organe ou d'un organisme et ainsi de suite, selon le type, la quantité et qualité des données et le niveau d'abstraction souhaité. De plus, plus il est possible d'intégrer de données dans le modèle, plus notre vision du système est fiable, car tout bruit dans les différents ensembles de données aura tendance à annuler et à intensifier le signal. Un autre facteur important dans l'émergence de la biologie des systèmes a été l'augmentation constante de la puissance des ordinateurs de bureau. Pour un aperçu de la biologie des systèmes, voir (Aderem 2005, Barabasi et Oltvai 2004, Cornish-Bowden 2006, Hood et al. 2004, Ideker et al. 2001, Kitano 2002, Xia et al. 2004).


Origines et évolution

RRD : Que sait-on de l'origine de ce virus SARS-CoV-2 qui cause le Covid-19 ? À quels virus ressemble-t-il le plus ? Sur la base de quoi ?

TG : C'est un parent génétique assez proche du SRAS, et les virus connus les plus étroitement liés sont les coronavirus trouvés chez les chauves-souris. Les chauves-souris sont de célèbres porteurs de agents pathogènes, car leur système immunitaire ne réagit pas aussi fortement aux agents pathogènes que, disons, le nôtre, donc les chauves-souris infectées ne présentent souvent pas de symptômes forts (pour autant que nous puissions en juger). Il existe des idées intéressantes sur les raisons de cela, liées à la quantité élevée de dommages cellulaires subis par les chauves-souris en tant qu'animaux volants. Si leur corps réagissait à cela, ils se suicideraient. Ils ont donc dû évoluer pour atténuer leur réaction à de tels dommages, et cela s'étend également aux agents pathogènes. Ils semblent bien se débrouiller avec un ventre plein de bagages viraux.

Le fait que les coronavirus de chauve-souris soient les parents les plus proches trouvés jusqu'à présent du SRAS-CoV-2 ne signifie pas qu'il provient directement d'eux. Il est plus que probable qu'il a sauté des chauves-souris à un hôte intermédiaire. Un suspect fort étant les pangolins.

Figure 2. Les pangolins, également connus sous le nom de fourmiliers écailleux, sont utilisés dans certaines médecines traditionnelles et également consommés. Ce sont des animaux étranges et magnifiques qui ne pourraient pas être inventés s'ils n'existaient pas. Cette image représente un pangolin terrestre (Smutsia temminckii) dans la réserve de gibier de Madikwe en Afrique du Sud. Photo de David Brossard. La consommation de pangolins est une double menace car elle menace simultanément le pangolin et ouvre la voie à l'origine de nouveaux virus lorsque les pangolins consommés coexistent sur les marchés avec d'autres hôtes tels que les chauves-souris.

RRD : Qu'est-ce qui pourrait influencer la capacité du SARS-CoV-2 à se propager d'humain à humain ?

KK : De nombreux virus respiratoires circulants chez l'homme se propagent par une combinaison de transmission par contact (deux personnes se touchent), de transmission aéroportée (je marche dans l'air dans lequel vous avez éternué) et de transmission environnementale (je touche quelque chose que vous avez touché). Si une personne doit éternuer ou tousser pour que la transmission du virus se produise, ce virus ne se propagera probablement pas aussi efficacement qu'un virus qui peut également rester sur les poignées de porte pendant 2-3 semaines, à partir duquel une personne peut contracter une infection virale sans jamais s'approcher d'une personne infectée. La qualité de la transmission de ce coronavirus par ces différentes voies de transmission est donc un facteur important dans sa capacité à se propager. Une autre chose qui aurait une grande influence sur la capacité de ce virus à se propager est le moment où un individu infecté présente des symptômes par rapport au moment où cet individu devient infectieux. Si un individu peut transmettre le virus avant de savoir qu'il est malade, alors le virus a un grand avantage et les efforts de contrôle de la maladie deviendraient moins efficaces.

RRD : Dans l'actualité, nous avons entendu dire qu'il existe différentes « souches » du virus. Ces nouvelles souches du virus ont-elles évolué depuis l'origine du virus à Wuhan, en Chine ? Comment savons nous?

TG : Il y a longtemps (comme il y a trois jours), il a été émis l'hypothèse qu'il pourrait y avoir 2 « souches », S et L. S a été émis l'hypothèse d'être la souche d'origine qui est entrée chez l'homme L a évolué à partir de S par la suite. Mais des analyses plus récentes constatent que la désignation de ces souches était prématurée. Ce qui ressemblait à deux souches n'était qu'une variation au sein d'une même souche sans aucun motif fort, que ce soit en ce qui concerne la géographie et l'histoire. Nous nous attendons à ce que de nouvelles souches évoluent, et certaines l'ont peut-être déjà fait, mais les données manquent pour savoir avec certitude si elles ont évolué, et encore moins si des souches qui ont évolué ou ont évolué possèdent de nouveaux traits, tels que la capacité de se propager plus facilement.

OK : Plus généralement, le virus va s'accumuler génétique mutation à mesure qu'il se propage parmi les humains et étend son aire de répartition géographique. Certains de ces mutants ne sont pas meilleurs ou moins bons pour se propager ou mieux pour se propager et se propager aux côtés des non-mutants. Ceux d'entre eux qui sont mieux capables de se reproduire, de survivre et de se propager augmenteront en fréquence chez l'homme.

KK : Une autre chose rapide à ajouter ici : certaines des mutations qui se produisent dans le virus ne modifient pas les acides aminés des protéines virales et ne sont donc pas censées avoir un effet important sur la forme physique du virus (c'est-à-dire son potentiel de transmission, ou la capacité de se propager entre les individus). Certaines mutations modifient les acides aminés des protéines virales, et la plupart du temps, ces mutations sont délétères. Ils rendent le virus moins capable de se propager. Cependant, une petite fraction des mutations sont bénéfiques. Ils augmentent le potentiel de transmission du virus.

Nous suivons schémas de circulation viraleen examinant tous ces types de mutations. En voyant quelles mutations deviennent plus courantes, nous pouvons également commencer à avoir une meilleure idée des mutations qui peuvent être bénéfiques et peuvent permettre au virus de mieux s'adapter aux humains. Que ces mutations soient effectivement bénéfiques ou non doit être confirmée expérimentalement, car d'autres facteurs (juste un hasard, des facteurs environnementaux dans différentes régions géographiques, etc.) pourraient également avoir un impact sur les changements dans la fréquence d'une mutation dans la population virale, en particulier au début d'une épidémie.

RRD : De quelles autres manières le virus pourrait-il évoluer ?

OK : Les souches mutantes pourraient être mieux à même de se propager parmi les humains, mais elles pourraient également développer la capacité de se propager vers et parmi d'autres animaux. Nous pouvons prédire quelle partie du virus pourrait être associée à ce que l'on appelle le « changement d'hôte ». Les virus doivent se fixer aux récepteurs des cellules hôtes. Avec le SRAS-CoV-2, nous savons que certains segments génétiques contrôlent la manière dont le virus se fixe aux récepteurs des cellules hôtes et y pénètre. Cela inclut, par exemple, quelque chose appelé le " domaine de liaison au récepteur " d'une protéine appelée " protéine de pointe " (elle est associée aux pointes à l'extérieur du virus). C'est ce segment génétique qui produit cette protéine qui reconnaît le récepteur hôte de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2). En conséquence, ce sont les gènes de ce segment génétique qui sont importants pour comprendre l'origine du virus.

RRD : En d'autres termes, nous nous attendons à ce que les gènes associés à la façon dont un virus frappe à la porte d'une cellule évoluent à mesure que le virus passe d'hôtes avec un type de porte à des hôtes avec un autre type de porte ?

OK : Plus ou moins, oui.

TG : Considérez la grippe A comme un exemple classique. La grippe aviaire a « sauté » chez les porcs où elle s'est adaptée et est devenue capable d'infecter et de se propager chez les humains, puis des porcs aux choses qui s'en nourrissent (par exemple, le vison au Danemark) ou se trouvent à proximité d'eux (les humains). Je ne sais pas s'il existe des retours documentés des humains aux porcs, etc., mais je le supposerais.

RRD : Pour dire l'implicite ici, la porte du cochon est plus similaire à la porte humaine que la porte de l'oiseau ne l'est à la porte humaine, donc le virus qui peut ouvrir la porte du cochon a une meilleure chance d'ouvrir la porte humaine.

TG : Nous avons peut-être poussé trop loin la métaphore, mais oui, vos récepteurs et mes récepteurs ressemblent plus à des récepteurs de porc qu'à des récepteurs de poulet.

MK : En reculant un peu ici, nous nous inquiétons principalement des maladies qui viennent des animaux et commencent à infecter les humains, mais nous redonnons aussi. La transmission de la grippe humaine aux porcs est assez courante. Il y a même eu quelques rapports de personnes ayant donné le H1N1* à leurs chiens et chats de compagnie en 2009. Et un chimpanzé dans un zoo de Chicago a contracté un virus respiratoire différent (métapneumovirus humain) des humains. On ne sait pas à quelle fréquence cela se produit car nous ne le recherchons vraiment pas beaucoup.

Mais j'ajouterai que si les mutations de ces virus les aident à trouver de nouveaux hôtes à infecter, nous pouvons également utiliser ces informations pour élaborer des thérapies. Certaines parties du virus ont des tâches très importantes à jouer, et si cette protéine mute trop ou au mauvais endroit, le virus ne peut pas se développer. Lorsque nous examinons les génomes de tous ces virus, nous pouvons voir ces régions et nous pouvons concevoir des médicaments pour agir contre ces parties du virus. Tout fait partie du course aux armements évolutionniste entre nous et les agents pathogènes.

* Le H1N1, également connu sous le nom de « grippe porcine », était responsable de la pandémie de grippe de 2009.
Figure 3. Une visualisation du virus. Les coronavirus sont des virus « enveloppés », cela signifie que le composant principal de leur enveloppe externe est composé d'une bicouche lipidique (affichée en gris) qu'il vole à la cellule infectée. En plus de la bicouche lipidique, l'enveloppe externe contient 3 protéines virales collectivement appelées protéines «structurelles» car elles font partie de l'enveloppe externe et donnent au virus sa forme et sa structure physiques. Les trois protéines structurelles du coronavirus sont appelées S, M et E. Les triangles rouges sont les « pointes » du virus (constitués de la protéine S) qui interagissent avec les récepteurs des cellules humaines. Ce sont les clés qui correspondent aux serrures de la cellule hôte. Les points oranges sont la protéine M (protéine membranaire) qui est la protéine structurale virale la plus abondante, elle aide la membrane (bicouche lipidique) du virus à se replier, et elle interagit avec les autres protéines. Enfin, les points jaunes sont la protéine E (protéine d'enveloppe). C'est la protéine structurelle la moins comprise, mais elle joue un rôle dans l'assemblage du corps du virion (un virion n'est qu'un virus), la libération du virus fille à partir des cellules hôtes infectées et la pathogenèse. À l'intérieur de l'enveloppe illustrée ici, avec sa membrane et ses protéines, se trouve l'ARN du virus, sur lequel se concentre une grande partie de notre discussion ici. L'illustration a été créée par le Center for Disease Control (CDC).

RRD : Le SARS-CoV-2 devrait-il devenir plus ou moins virulent à mesure qu'il se propage ? Pourquoi?

TG : Question difficile.D'un point de vue évolutif, pour survivre, le virus doit maximiser sa propagation et persister. S'il tue trop vite, il ne sera pas transmis. Si, cependant, il évolue de manière à réduire son taux de réplication chez un individu humain, il y aura si peu de virus dans les choses désagréables que nous nous transmettons (morve, crachat, autre…), il ne se transmettra pas. . Une forme « idéale » (idéale du point de vue du virus) serait peut-être comme le rhume, ça vous fait un peu chier, mais pas assez pour vous mettre au lit (donc éviter les autres). Il vous fait éternuer et dribbler, afin de le transmettre aux autres. Mais cela ne vous tue pas, ce qui vous permet de continuer à éternuer, à baver et à vous répandre. Notez qu'à ce stade, cela peut déjà être idéal car cela ne tue pas la plupart des gens, et cela ne tue certainement pas les meilleures personnes pour la propager (les jeunes actifs et les enfants qui se déplacent beaucoup plus que les personnes âgées et les infirmes. Donc, je serais en fait surpris si cela devenait très différent de ce qu'il est maintenant. Il n'y a tout simplement pas grand-chose à sélectionner pour l'empêcher d'être pathogène pour les personnes âgées/infirmes.

DR : L'une des raisons pour lesquelles le SRAS-CoV-2 est particulièrement mortel est que l'inflammation qu'il provoque dans les poumons provoque des symptômes de type pneumonie. Il s'agit en grande partie de dommages auto-infligés résultant de notre propre réaction inflammatoire. Il n'est pas clair que provoquer de tels symptômes semblables à ceux d'une pneumonie profite au virus et peut même réduire son potentiel de transmission en rendant les personnes infectées moins mobiles. Il est donc possible qu'il y ait une sélection sur le virus pour déclencher une réponse immunitaire moins agressive dans les poumons. Mais il se peut aussi que la réponse immunitaire soit davantage sous le contrôle de l'hôte que du virus. Cela semble certainement être le cas chez les souris où il existe une énorme variation génétique entre les différentes souches de souris dans leur réponse immunitaire aux coronavirus de type SAR.

RRD : Le virus idéal rendrait également son hôte plus social, moins disposé à obliger les efforts de distanciation sociale.

TG : Pour continuer… s'il saute de l'homme à une autre espèce à nos côtés (et il n'a clairement aucun problème à sauter sur des distances assez grandes… même si ce n'était pas directement d'une chauve-souris à l'homme mais via un intermédiaire…) alors cela pourrait aussi changer son vitesse d'évolution. Et peut-être en faire plus, ou moins, virulent/pathogène. A la fois quelle que soit la nouvelle espèce hôte, et la nouvelle future espèce hôte, mais aussi si elle retombe dans l'homme.

RRD : Que peut-on prévoir d'autre sur son évolution ?

TG : Il continuera certainement à se diversifier en de plus en plus de souches (ou pour être plus précis, de sous-clades). On peut voir si cela a un effet biologique, mais on pourrait s'attendre à ce que cela ait des ramifications pour l'efficacité de vaccins…et mandater le développement de vaccins spécifiques à la souche (un peu comme avec la grippe-A).

MK : Je suis d'accord avec Tom (TG), mais j'ajouterai qu'il est vraiment difficile de savoir maintenant ce qui va se passer, mais ce que nous ferons ou ne ferons pas en réponse influencera son évolution. Ne pas suggérer que les vaccins sont mauvais, nous avons besoin d'un vaccin, mais à mesure que la population se développe immunité qui appliquera de nouvelles pressions évolutives sur le virus.

RRD : Lequel des gènes du virus évolue le plus rapidement ? Quels gènes doivent évoluer pour permettre au virus de réussir chez l'homme (par rapport, par exemple, aux chauves-souris ou aux pangolins) ?

TG : Nous devons parler à un virologue ou à quelqu'un comme Eddie Holmes* qui regarde les séquences générées à ce jour pour avoir une bonne réponse à ce sujet ! Mais il s'agit probablement de gènes soumis à la sélection la plus forte pour éviter le système immunitaire ou pour pénétrer dans les cellules, donc à l'extérieur du virus.

MK : En tant que virologue, je dirai que cela va changer avec le temps. Dès le début, lorsqu'il a « fait le saut » vers les humains et a évolué pour se propager d'une personne à l'autre, il y avait probablement une pression sur de nombreux gènes différents. Les gènes de la surface externe qui se lient à nos cellules et ses autres gènes qui sont utilisés pour prendre en charge nos cellules. Maintenant que cela a été avec succès chez l'homme pendant un certain temps, la majorité de la pression évolutive sera sur la protéine de pointe (encore une fois, c'est la protéine associée aux pointes à l'extérieur du virus qui l'aident à se lier aux cellules hôtes) et d'autres protéines clés associées à la membrane du virus. Cependant, certaines parties de cette protéine sont essentielles pour se lier au récepteur de la cellule hôte. Ainsi, l'évolution se produira probablement de manière à conserver cette partie de la protéine, mais changera toujours le reste de manière à ce que notre système immunitaire ne la reconnaisse plus.

* Tom a envoyé un e-mail à Eddie. Eddie n'a pas précisé quels gènes pourraient évoluer le plus rapidement, mais a déclaré qu'il n'y avait aucune preuve que les gènes de virulence l'étaient encore.

RRD : En quoi l'évolution ou la propagation du virus serait-elle différente si la plupart des gens étaient vaccinés contre lui (en imaginant l'existence et la diffusion d'un vaccin) ?

KK : Il y a deux résultats généraux possibles de la vaccination contre un virus comme celui-ci… Si les taux de vaccination sont suffisamment élevés, le virus ne pourra pas continuer à circuler et s'éteindre. Le niveau de vaccination requis est appelé seuil de vaccination, et il dépend du potentiel de transmission («numéro de reproduction de base», R0) du virus. Plus le potentiel de transmission est élevé, plus la proportion de la population qui doit être vaccinée pour arrêter (ou même ralentir) le virus est élevée. Si la vaccination se produisait toujours à des niveaux relativement élevés, mais pas suffisamment élevés pour empêcher le virus de se propager, alors la vaccination de certains individus (à condition que le vaccin soit un vaccin protecteur à haute efficacité) protégerait également certains des individus non vaccinés. C'est ce qu'on appelle « l'immunité collective » et cela se produit parce que la vaccination réduit la quantité de virus en circulation et, par conséquent, le taux d'infection des individus non vaccinés.

Figure 4. L'axe des abscisses montre les taux de reproduction de base (R0) de différents virus. L'axe des y montre la proportion de personnes qui doivent être vaccinées pour arrêter un virus (pc). Le SRAS-CoV-2 est à environ 3,0, la grippe saisonnière à 2, la varicelle à 10 et la rougeole à 16. Cette comparaison offre une petite bonne nouvelle sur le SRAS-CoV-2 en ce sens qu'une fois qu'un vaccin est développé, largement disponible et utilisé dont une plus petite proportion de la population a besoin pour qu'il soit efficace que ce n'est le cas pour la rougeole. La mise en garde est que soixante pour cent de la population mondiale (lecture sur l'axe des y) est beaucoup de vaccinations. Sur la base d'un chiffre similaire dans Keeling, M. J., & Rohani, P. (2011). Modélisation des maladies infectieuses chez l'homme et l'animal. Presse de l'Université de Princeton.

OK : J'imagine le virus circulant dans des poches d'individus non vaccinés, qu'ils soient cas ou asymptomatiques.

KK : Il est également possible que la vaccination à des niveaux élevés (mais inférieurs au seuil de vaccination) puisse exercer des pressions de sélection sur le virus pour échapper à l'immunité de l'hôte fournie par le vaccin. Dans ce cas, le vaccin peut finalement devoir être reformulé pour être basé sur une souche virale différente.

DR : Humain anticorps contre les coronavirus ciblent le domaine Spike (les triangles rouges sur la figure 4), la même protéine que le virus utilise pour lier les récepteurs cellulaires humains comme ACE2 (ces portes encore). Cela met le virus dans une situation évolutive car si ses pics changent trop, ils ne peuvent pas se lier aux récepteurs de l'hôte, mais s'ils ne changent pas assez, ils sont attaqués par le système immunitaire de l'hôte. Mais cette situation n'est pas unique aux coronavirus. Par exemple, la protéine hémagglutinine de la grippe sert également de protéine de liaison au récepteur et est également une cible majeure des anticorps humains. Nous savons en étudiant des virus comme la grippe que ces protéines sont assez flexibles dans leur capacité à tolérer des mutations qui leur permettent d'échapper à l'immunité tout en conservant leurs autres fonctions biologiques. Ma prédiction, bien que spéculative, est donc que le SRAS-Cov-2 sera capable d'échapper aux anticorps humains générés soit par un vaccin, soit par une immunité naturelle. En effet, il existe des preuves préliminaires que d'autres coronavirus humains courants comme le HCoV-OC43 évoluent pour échapper à l'immunité basée sur les anticorps. Il est important de noter que cela ne diminue en rien l'importance du développement d'un vaccin, mais plutôt que le vaccin devra peut-être être mis à jour au fil du temps, comme Katia (KK) l'a mentionné ci-dessus.

MK : Cela dépend du type d'immunité conférée et de sa durée. Il existe des vaccins qui fournissent «immunité stérilisante” et puis il y en a d'autres qui ne font que prévenir la maladie. Ces différents types de protection entraînent différemment l'évolution des virus. La stérilisation de l'immunité est ce que nous recherchons dans la plupart des circonstances et c'est le type d'immunité que le vaccin antigrippal espère conférer, et le fait lorsque le vaccin est bien adapté à la souche en circulation. Dans ce cas, vous avez induit des niveaux élevés d'anticorps chez la personne avant qu'elle ne soit infectée, puis lorsque le virus apparaît, les anticorps empêchent le virus de démarrer. C'est pourquoi tous les dix ans environ, vous constatez un changement dans le sous-type dominant d'HA dans les cas humains de grippe saisonnière. Lorsque toute la population a une immunité stérilisante (par vaccination ou infection), ce sous-type ne circule plus très bien et est remplacé par un autre.

Si vous n'obtenez pas d'immunité stérilisante, vous vous retrouvez avec une infection de faible niveau (et les anticorps ralentissent mais n'arrêtent pas le virus dans votre corps), mais ce n'est pas assez grave pour vous envoyer chez le médecin. Cette infection subclinique permet au virus de se répliquer chez l'homme et de capter de nouvelles mutations, puis ce n'est qu'une question de sélection darwinienne jusqu'à ce qu'un virus qui se propage plus rapidement ou tue plus rapidement émerge. Il existe quelques exemples de cela chez l'homme, mais l'exemple le mieux étudié est le vaccin contre le virus de la maladie de Marek chez les poulets. Depuis que ce vaccin a été introduit pour la première fois dans les années 1950, une version plus virulente du virus est apparue tous les 10 à 20 ans, nécessitant un nouveau vaccin.

RRD : A quoi faut-il faire attention en ce qui concerne la biologie du virus ? Quelles sont les inconnues ?

TG : Est-ce qu'il/ses souches muteront d'une manière qui annulera l'efficacité du tests diagnostiques? Ou affecter l'efficacité des vaccins ?

RRD : Oh putain, je n'avais pas pensé à la possibilité que les souches puissent évoluer de manière à devenir indétectables.

MK : Il est encore tôt, mais pour moi la grande question est à quoi ressemble l'immunité contre ces virus. Combien de temps cela dure-t-il? Il y a plusieurs coronavirus que nous voyons tous chaque année. Ils provoquent le rhume. Chaque année, nous sommes infectés par plus ou moins les mêmes virus car notre immunité contre ces virus ne dure que 6 mois environ. En sera-t-il de même pour le SARS-CoV-2 ? Ou peut-être que nous serons toujours infectés par le SRAS-CoV-2 mais la prochaine fois, il fera juste froid.

RRD : Qu'est-ce que je n'ai pas demandé que j'aurais dû (et si vous posez la question, offrez également une sorte de réponse) ?

TG : Covid-19 est une chose, mais ce ne sera certainement pas la seule fois où cela se produira. Comment empêcher que cela se reproduise ? Et comment gérons-nous les problèmes un peu embarrassants selon lesquels, lorsque les gouvernements agissent mal (par exemple, suppriment la vérité et minimisent l'effet sur les complots), il est sacrément difficile d'empêcher que cela ne se reproduise. Pour être honnête, je pense que nous avons eu beaucoup de chance avec Covid-19 par rapport à ce que nous aurions pu obtenir.

JC : Je pense qu'il faut réfléchir comment nous adaptons nos réponses à la biologie des virus. Jusqu'à Ebola, le financement de l'État et des habitants était catégorique par maladie. Nous nous sommes battus très fort pour dire que toutes les réponses sont, à la base, les mêmes avec des nuances spécifiques à la maladie et largement liées à la portée, à l'échelle et au mécanisme de transmission. Chaque réponse s'appuyait vraiment sur la précédente. Heureusement/malheureusement, les épidémies n'étaient jamais assez proches pour tester si ce que nous faisions était correct et plusieurs fois nous avons dû réapprendre certaines des pratiques. De plus, il n'y a jamais eu de méthodes de recherche solides développées pour tester les composantes de la réponse, dont la plupart ont été adoptées à partir de la pratique de santé publique « quotidienne » à petite échelle ou d'autres pratiques de réponse aux urgences non sanitaires.

Cela signifie que nous avons fait des hypothèses sur les résultats et avons été surpris lorsque, par exemple, le H1N1 avait un taux de létalité particulièrement élevé chez les femmes enceintes et que les personnes âgées étaient quelque peu protégées. Ceci est très différent de la grippe saisonnière qui était le modèle de prédiction des populations à risque. Et cela n’a été réalisé que bien avant la pandémie. Les méthodes telles que les essais contrôlés randomisés ne fonctionnent tout simplement pas en cas d'urgence et l'adaptation d'autres méthodologies de recherche, y compris l'analyse qualitative, n'est pas encore tout à fait respectée.

JC : De plus, pour Covid-19, il aurait été bien d'avoir l'infrastructure de recherche/évaluation en place pour évaluer à quel point la quarantaine était ou n'était pas efficace et quelles étaient les nuances qui l'ont rendue ainsi. d'autant plus efficace qu'elle s'étend géographiquement. Par exemple, la quarantaine communautaire à Wuhan a réussi à atténuer la propagation vers l'extérieur (notez que la quarantaine dans ce cadre n'est pas destinée à éliminer la propagation, il suffit de l'émousser pour que les autres puissent se préparer et que le système de santé ne soit pas submergé) mais la quarantaine des navires de croisière probablement échoué pour ceux qui se trouvaient sur le navire. Une taille ne convient pas à tous.

RRD : Y a-t-il une capacité particulière d'un virus ou une histoire sur un virus (autre que le coronavirus) qui vous fascine particulièrement ?

Figure 5. Micrographie électronique d'un mimivirus. Imaginez par Ghigo E, Kartenbeck J, Lien P, Pelkmans L, Capo C, Mege JL, Raoult D. De… PLoS Pathog. 2008 juin 134(6) : e1000087. doi: 10.1371/journal.ppat.1000087.

DR : On a tendance à penser plus virus en tant que spécialistes hautement adaptés pour infecter une seule espèce. Ces spécialistes sont confrontés à des compromis qui limitent la capacité d'une souche particulière de virus à infecter plusieurs espèces différentes. Qu'est-ce que

Malheureusement pour nous, les virus tels que les coronavirus de type SAR ressemblent en fait davantage à des généralistes et peuvent prospérer dans de nombreux hôtes différents. Tout ce dont ils ont besoin, c'est d'un peu de temps pour s'adapter à un nouvel hôte. Pour moi, c'est assez inspirant que quelque chose d'aussi petit et limité en termes de taille de génome puisse être si flexible.

TG : Eh bien, il y a les mimivirus géants qui causent des maux de tête philosophiques sur ce qui définit un virus. Typiquement, ils sont à la fois aussi gros en taille génomique et en taille physique que les bactéries telles que Rickettsia , et leurs génomes codent pour des produits qui n'ont normalement pas été observés dans les virus, y compris pour la synthèse de nucléotides et d'acides aminés. Mais d'un autre côté, ils n'ont pas le mécanisme de traduction des protéines et de métabolisme énergétique, qui sont des traits que nous associons normalement aux organismes vivants.

OK : Virus Influenza A (déplacement et dérive antigéniques). Koala rétrovirus (à la fois exogène, c'est-à-dire transmis entre individus, et endogène, c'est-à-dire hérité du parent à la progéniture).

JC : En ce qui concerne mon agent préféré du point de vue de la préparation : ce doit être la grippe. Ce petit bougre est tout simplement trop adaptatif pour que nous puissions le maîtriser et nécessite une toute nouvelle approche. Nous devons avoir des plans en place et un vaccin qui n'a pas besoin de révisions annuelles. Tout cela est cohérent avec le renforcement de la résilience, qu'elle soit biologique, sociale ou comportementale : absorber le traumatisme et être prêt pour la prochaine fois.

TG : Et puis il y a des virus humains qui doivent avoir une origine animale mais il n'est vraiment pas évident de savoir de quel animal. Je pense, par exemple, que la variole n'a toujours pas une bonne explication d'origine animale. Et il y a le virus de l'herpès sauvage. Ce qui me fait juste rire de son nom.

MK : Combien de temps avez-vous, dit le virologue. Tout ce qui précède, mais probablement l'un de mes sujets préférés est le domaine relativement nouveau qui examine transfert horizontal de gènes par des virus (des virus à leurs hôtes et des hôtes aux virus) et comment ils ont pu aider les plantes et les animaux à faire des sauts majeurs dans l'évolution. À titre d'exemple, il existe des preuves que les gènes des rétrovirus ont en fait fourni le bloc de construction pour permettre le développement du placenta.


2. MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1 Séquençage de deux isolats australiens

Deux isolats australiens (BetaCoV/Australia/VIC02/2020 et BetaCoV/Australia/SA01/2020) ont été séquencés avec la plateforme MiSeq (Illumina, Inc). En bref, l'ARN a été purifié à partir de chaque isolat en utilisant un kit Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research). L'ARN purifié a été rétrotranscrit à l'aide d'un kit de transcription inverse TaqMan (Applied Biosystems) avec des octamères aléatoires liés à une séquence d'amorce spécifique, suivi d'une synthèse d'ADNc du deuxième brin en utilisant l'ADN polymérase I de Klenow (Promega). L'ADN complémentaire a été encore amplifié (à l'aide d'amorces spécifiques aux séquences ajoutées aux octamères aléatoires utilisés pour la transcription inverse) avec un kit KAPA HiFi HotStart (Roche). L'ADN résultant a été purifié en utilisant un kit DNA Clean and Concentrator (Zymo Research). La fragmentation et la préparation de bibliothèques à double indice ont été réalisées à l'aide d'un kit de préparation de bibliothèques d'ADN Nextera XT (Illumina, Inc), et les bibliothèques dénaturées ont été séquencées à l'aide d'un kit de réactifs MiSeq v2 à 300 cycles (Illumina, Inc). Les lectures de séquençage ont été rognées pour la qualité et mappées à la séquence de référence publiée (BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019 GenBank numéro d'accession NC_045512.2) à l'aide de Geneious 11.1.4. Des séquences génomiques de consensus pour les isolats ont été générées pour analyse.

2.2 Pré-traitement et alignement GISAID

Toutes les séquences virales disponibles ont été téléchargées depuis GISAID (le 05/03/2020, voir Annexe S3 (Elbe, & Buckland-Merrett, 2017)), en filtrant les séquences complètes d'origine humaine (187 génomes au total). Les séquences de faible qualité (définies comme des séquences avec une teneur en N supérieure à 1 %) ont été filtrées, laissant 178 souches au total. Nous avons également inclus une séquence virale récemment signalée dans l'European Virus Archive global (Réf-SKU : 026V-03883) et les deux séquences australiennes dans l'ensemble de données complet.

Cet ensemble de données de 181 séquences a été aligné les uns contre les autres à l'aide de Muscle (v3.8.31) (Madeira et al., 2019). Sur la base des alignements, nous avons pu constater une variation significative aux extrémités des séquences (figure S1), probablement en raison d'artefacts de séquençage et d'erreurs empêchant le séquençage des génomes viraux complets. Pour réduire l'impact des erreurs de séquençage potentielles, nous avons écrit un script perl personnalisé pour rogner les séquences de telle sorte que seules les positions avec une couverture de 95% soient conservées. Ce rognage impliquait de retirer les 101 premières et les 72 dernières pb des alignements.

Une fois coupés et convertis tous les « U » en « T », nous avons identifié 54 séquences identiques. Pour limiter l'effet des séquences en double sur les analyses ultérieures, nous les avons regroupés en une seule entrée. Ces séquences effondrées sont résumées dans le tableau S1.

Pour valider la méthodologie, nous avons inclus des séquences d'autres coronavirus. Nous avons choisi un mélange de contrôles comme suit : 7 séquences SRAS d'origine humaine (numéros d'accession GenBank AY274119.3, AY291451.1, AY502923.1, AY502932.1, AY559083.1, AY559084.1 et AY559087.1), 10 SRAS séquences d'origine chauve-souris (numéros d'accès KY417142.1 à KY417152.1), 4 séquences MERS d'origine humaine (numéros d'accès KJ477102.1, KT006149.2, KT026453.1 et KT029139.1) et 2 séquences MERS d'origine chauve-souris (accès numéros MG596802.1 et MG596803.1).

2.3 Arbre phylogénétique

L'arbre phylogénétique du maximum de vraisemblance a été généré à partir des alignements ci-dessus à l'aide de RAxML-NG (Kozlov, Darriba, Flouri, Morel et Stamatakis, 2019). Le modèle évolutif utilisé était un modèle général réversible dans le temps avec une hétérogénéité de vitesse à distribution gamma et des sites invariants (GTR + G + I). Nous utilisons ce mode car il s'agit du modèle le plus général et il a été proposé de produire des arbres égaux à des modèles sélectionnés de manière optimale (Abadi, Azouri, Pupko, & Mayrose, 2019 ). L'arbre a été visualisé à l'aide d'iTOL (Letunic & Bork, 2019) comme arbre à racine médiane et montre les relations évolutives probables entre les souches échantillonnées.

2.4 Méthode K-mer

Chaque organisme et potentiellement isolat peut avoir une signature génomique unique basée sur la composition de sa séquence génomique. Pour quantifier cette signature, nous avons déterminé la fréquence K-mer. Le comptage de toutes les chaînes possibles de longueur k dans la séquence du virus est devenu une alternative aux arbres phylogénétiques dans d'autres disciplines (Sims, Jun, Wu et Kim, 2009). La distance conceptuelle entre tous les isolats peut ensuite être visualisée en exécutant une analyse en composante principale (ACP) sur toutes les signatures génomiques pour réduire ce vecteur de fréquence K-mer de haute dimension dans un espace à deux dimensions (Jolliffe & Cadima, 2016). Veuillez consulter l'annexe S1 pour plus de détails sur cette méthode.

Des scripts personnalisés ont été utilisés pour calculer la fréquence K-mer pour chaque séquence en utilisant un k de 10 (Sims et al., 2009). Les K-mers contenant des bases ambiguës (c'est-à-dire les N) ont été éliminés. Nous avons ensuite calculé la proportion relative de chaque K-mer, résultant en un vecteur de fréquence. Nous avons utilisé l'implémentation PCA de Python scikit-learn pour réduire les signatures génomiques contenant 1 048 576 proportions 10-mères en un vecteur contenant deux composants principaux. Enfin, des scripts personnalisés ont été utilisés pour comparer les signatures génomiques de toutes les séquences de coronavirus susmentionnées.


Sélection d'amorces dans HTS

Dans la recherche fongique, diverses amorces PCR ciblant le locus de l'ARN ribosomique (ARNr), principalement l'espaceur interne transcrit (ITS), ont été utilisées dans les études initiales de diversité de l'OM (Selosse et al., 2004 Shefferson et al., 2005 Bonnardeaux et al., 2007). Cependant, une séquence accélérée d'ADNr complique l'amplification de l'un des taxons OMF les plus courants (Taylor et al., 2002 Binder et al., 2005), la famille des Tulasnellaceae (voir ci-dessous), entraînant le développement et l'optimisation de la PCR spécifique à l'OM. amorces.

Taylor et McCormick (2008) ont d'abord développé des amorces spécifiques ITS1-OF et ITS4-OF pour étudier la diversité de l'OM en amplifiant l'ITS complet basé sur les séquences de champignons Basidiomycètes, y compris Tulasnella espèce. Cet ensemble a été largement utilisé pour l'identification de l'OM passant par clonage et séquençage (Xing et al., 2015, 2017, 2019 Jacquemyn et al., 2016a Kaur et al., 2019 Rammitsu et al., 2019). L'amorce ITS4Tul conçue par Taylor (1997) est également largement utilisée pour rechercher Tulasnella diversité avec les amorces ITS1 ou ITS5 (Bidartondo et al., 2003 Abadie et al., 2006 Taylor et McCormick, 2008 McCormick et al., 2012, 2016). Plus tard, un in silico l'analyse a suggéré que les amorces ITS3/ITS4OF et ITS86F/ITS4, ciblant la sous-région ITS2 de l'ITS, étaient les plus idéales pour les échantillons de racines d'orchidées (Waud et al., 2014), même si elles ne donnent pas toujours de bons résultats sur les échantillons de sol. De plus, parce que ITS2 peut produire plus d'unités taxonomiques opérationnelles (OTU) et une richesse phylogénétique plus élevée que l'autre sous-région ITS1, de nombreux chercheurs le préfèrent pour l'identification fongique via les plateformes HTS (Mello et al., 2011 Tedersoo et Lindahl, 2016 Nilsson et al. ., 2019). Au cours des cinq dernières années, les ITS3/ITS4OF ont été fréquemment utilisés pour identifier les communautés de champignons mycorhiziens dans les racines d'orchidées terrestres et les sols environnants (Jacquemyn et al., 2015a, 2017b Esposito et al., 2016 Duffy et al., 2019). De plus, ITS86F/ITS4 est toujours utilisé pour la détection des partenaires mycorhiziens des orchidées épiphytes (Cevallos et al., 2017, 2018a Herrera et al., 2019b Izuddin et al., 2019 Jacquemyn et al., 2021).

Notamment, ITS4OF présente quatre mésappariements avec 64% des Tulasnellaceae, et de multiples mésappariements dans d'autres assemblages de Basidiomycota et Ascomycota. De même, considérant que ITS86F a cinq discordances dans 83 % des Tulasnellaceae, Oja et al. (2015) ont marqué les amorces modifiées ITS1ngs, ITS1Fngs et ITS4ngs, et ont développé l'amorce ITS4Tul2 pour toute la longueur de l'ITS. Leur utilisation intégrée correspondait à la plupart des assemblages mycorhiziens connus d'orchidées (dont 97% de Tulasnellaceae). Récemment, une amorce nouvellement développée 5.8S-OF combinée à deux amorces inverses différentes (ITS4OF et ITS4Tul) a révélé un bon succès sur OMF (Vogt-Schilb et al., 2020).

Les Tulasnellaceae (de l'ordre des Cantharellales) sont les principaux symbiotes mycorhiziens des orchidées, principalement ses clades A et B. Par rapport au clade A, le clade B est bien différencié et à peine amplifié par les amorces générales ou même par les amorces spécifiques aux Tulasnellaceae (Girlanda et al. , 2011 Lindahl et al., 2013). Selon la base de données conviviale Nordic ITS Ectomycorhiza (UNITE) dédiée à l'identification moléculaire des champignons, environ 3/4 des séquences de Tulasnellaceae appartiennent au clade A. pourraient être sous-représentées, bien qu'elles soient tout aussi courantes (Oja et al., 2015). Par conséquent, les futures études axées sur la diversité de l'OM devraient choisir méticuleusement les amorces et évaluer leurs biais potentiels.

On peut être conscient qu'aucun jeu d'amorces n'est parfait et envisager d'utiliser plusieurs jeux disponibles au moment de la conception de l'étude. Sur la base de cela et d'une série de travaux de notre équipe de recherche (données non publiées), il est fortement recommandé de poursuivre plusieurs paires d'amorces avec un faible chevauchement d'amplification. Ils peuvent être fusionnés et combinés à une méthode d'amplification PCR nichée pour identifier le nombre maximum de partenaires mycorhiziens d'orchidées (Oja et al., 2015 Voyron et al., 2017 Vogt-Schilb et al., 2020). L'utilisation de trois paires d'amorces optimisées, ITS1ngs-ITS4ngs, ITS1Fngs-ITS4ngs et ITS1-ITS4Tul2, a été recommandée pour 454 pyroséquençage. Pour le séquençage d'amplicons à l'aide de MiSeq PE300 et HiSeq PE250, deux paires d'amorces (Figure supplémentaire S1), à savoir ITS1F-ITS4 et ITS1-ITS4Tul peuvent être recommandées pour le premier cycle d'amplification (Gardes et Bruns, 1993 Bidartondo et al., 2003) . Les produits PCR peuvent ensuite être soumis à une amplification PCR nichée à l'aide des amorces ITS86F-ITS4 et ITS86F-ITS4Tul, qui capturent une grande diversité de champignons mycorhiziens associés à 72 variétés d'orchidées épiphytes tropicales cultivées à l'état sauvage (Li et al., non publié). Pour le séquençage PacBio Sequel de troisième génération, des amorces optimisées ITS1ngs-TW14ngs, ITS1Fngs-TW14ngs et ITS1-ITS4Tul2 peuvent être recommandées (voir le tableau supplémentaire S1 pour les séquences d'amorces mentionnées ci-dessus). À l'avenir, le séquençage au fusil de chasse des racines, qui ne fournit aucune amplification PCR, alors qu'un champignon peut être observé, peut permettre de démêler des clades qui échappent à toutes les amorces disponibles, le cas échéant.


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3. Résultats

3.1 Diversité mondiale des CoV

Un total de 19 192 animaux et humains ont été testés pour la présence de CoV par PCR consensus (cPCR) (tableau 1). La majorité étaient des chauves-souris (n = 12 333), représentant 282 espèces de douze familles. Dans l'ensemble, la proportion d'individus positifs au CoV était de 8,6 % chez les chauves-souris (n = 1 065/12 333) et de 0,2 % chez les non-chauves-souris (n = 17/6 859). En d'autres termes, plus de 98% de tous les individus positifs étaient des chauves-souris.

Résumé des individus testés et nombre positif pour au moins un coronavirus par taxon hôte.

Taxons hôtes testés. Nombre d'individus testés. Nombre d'individus positifs. Aucun virus distinct détecté .
Chauves-souris 12,333 1,065 91
Primates non humains 3,470 4 2
Rongeurs et musaraignes 3,387 11 7
Humains 1,124 2 2
Le total 19,192 1,082 100 un
Taxons hôtes testés. Nombre d'individus testés. Nombre d'individus positifs. Aucun virus distinct détecté .
Chauves-souris 12,333 1,065 91
Primates non humains 3,470 4 2
Rongeurs et musaraignes 3,387 11 7
Humains 1,124 2 2
Le total 19,192 1,082 100 un

a Remarque : Les nombres ne totalisent pas car deux virus ont été détectés dans deux taxons.

Résumé des individus testés et nombre positif pour au moins un coronavirus par taxon hôte.

Taxons hôtes testés. Nombre d'individus testés. Nombre d'individus positifs. Aucun virus distinct détecté .
Chauves-souris 12,333 1,065 91
Primates non humains 3,470 4 2
Rongeurs et musaraignes 3,387 11 7
Humains 1,124 2 2
Le total 19,192 1,082 100 un
Taxons hôtes testés. Nombre d'individus testés. Nombre d'individus positifs. Aucun virus distinct détecté .
Chauves-souris 12,333 1,065 91
Primates non humains 3,470 4 2
Rongeurs et musaraignes 3,387 11 7
Humains 1,124 2 2
Le total 19,192 1,082 100 un

a Remarque : Les nombres ne totalisent pas car deux virus ont été détectés dans deux taxons.

Des séquences partielles ont été obtenues à partir de deux fragments non chevauchants du gène orf1ab, donnant 654 séquences pour la région « Quan » et 950 pour la région « Watanabe » (voir « Méthodes »). Il y avait un chevauchement de 27%, où les séquences ont été obtenues pour les deux régions à partir du même échantillon. La distribution des identités de séquences par paires définissait un seuil de 90 % entre les taxons (Fig. 1) et les groupes monophylétiques résultants (dans lesquels toutes les séquences avaient ≥ 90 % d'identité) utilisés comme unités taxonomiques opérationnelles. Les groupes partageant moins de 90 % d'identité avec une séquence connue ont été étiquetés séquentiellement comme PREDICT_CoV-1, -2, -3 etc. tandis que les groupes partageant ≥ 90 % d'identité avec une séquence déjà dans GenBank étaient considérés comme des souches d'un virus connu et attribués le même nom que la séquence correspondante (par exemple Kenya_bat_CoV_KY33 ou HKU-9). Les séquences partageant >90% d'identité mais trouvées dans des hôtes différents ont été considérées comme faisant partie de la même unité taxonomique. Sur la base de ces critères, 100 taxons viraux discrets ont été identifiés, dont 91 ont été trouvés chez les chauves-souris ( Tableau 1 Fig. 2). Il est important de noter que nous ne prétendons pas que ces groupes correspondent à des «espèces», car des séquences complètes de réplicase orf1ab seraient nécessaires pour cela (King et al. 2012). Au lieu de cela, nous clarifions que nous utilisons ces fragments partiels pour regrouper des séquences en « unités taxonomiques opérationnelles » (analogue au regroupement OTU dans la recherche sur le microbiome). Nous soulignons également que notre seuil a été déterminé sur la base de deux régions discrètes au sein de l'orf1ab séparées par >3 000 nucléotides, et que ces régions correspondent au clivage post-traductionnel de peptides uniques.

Histogramme de la fréquence relative des identités de séquences par paires utilisées pour définir la coupure entre les unités taxonomiques opérationnelles pour toutes les séquences de CoV détectées. Une distribution bimodale a été observée et un seuil d'identité de séquence de 90 % a été utilisé pour séparer les séquences des tests Watanabe (Panneau A) et Quan (Panneau B) en taxons viraux discrets.

Histogramme de la fréquence relative des identités de séquences par paires utilisées pour définir la coupure entre les unités taxonomiques opérationnelles pour toutes les séquences de CoV détectées. Une distribution bimodale a été observée et un seuil d'identité de séquence de 90 % a été utilisé pour séparer les séquences des tests Watanabe (Panneau A) et Quan (Panneau B) en taxons viraux discrets.

Reconstructions phylogénétiques à probabilité maximale pour tous les fragments partiels de CoV RdRp pour les tests Quan (Panneau A) et Watanabe (Panneau B). Les séquences sont regroupées en clades, représentant nos unités taxonomiques opérationnelles (séquences partageant ≥90% d'identité) et le nombre de séquences pour chaque taxon est indiqué entre parenthèses. Des séquences publiées représentatives de GenBank ont ​​été incluses à des fins de comparaison (numéro d'accession GenBank indiqué). Les deux arbres ont été enracinés à l'aide du virus Breda connexe (NC_007447) et tous les nœuds ont un support bootstrap ≥ 60 %. Les diagrammes circulaires indiquent la distribution des taxons viraux par famille d'hôtes (chauve-souris), dans chaque sous-clade de virus.

Reconstructions phylogénétiques à probabilité maximale pour tous les fragments partiels de CoV RdRp pour les tests Quan (Panneau A) et Watanabe (Panneau B). Les séquences sont regroupées en clades, représentant nos unités taxonomiques opérationnelles (séquences partageant ≥90% d'identité) et le nombre de séquences pour chaque taxon est indiqué entre parenthèses. Des séquences publiées représentatives de GenBank ont ​​été incluses à des fins de comparaison (numéro d'accession GenBank indiqué). Les deux arbres ont été enracinés à l'aide du virus Breda connexe (NC_007447) et tous les nœuds ont un support bootstrap ≥ 60 %. Les diagrammes circulaires indiquent la distribution des taxons viraux par famille d'hôtes (chauve-souris), dans chaque sous-clade de virus.

Il convient de noter la détection de séquences de CoV du sous-groupe 2a chez les chauves-souris, les humains et les primates non humains de quatre pays différents. Ce sous-clade est largement considéré comme le sous-clade des rongeurs ( Lau et al. 2015 Wang et al. 2015 Tsoleridis et al. 2016), mais ici nous avons détecté des séquences correspondant au virus connu betacoronavirus-1 dans Pteropus moyen du Bangladesh, Pteropus alecto d'Indonésie, et d'humains en Chine, et des séquences correspondant au coronavirus murin chez des primates non humains du Népal (ces séquences ont été détectées par quatre laboratoires différents, et aucun échantillon de rongeur n'a été traité en même temps) (Fig. 2). En outre, nous rapportons la découverte de plusieurs clusters de séquences CoV 2b et 2c des sous-clades (respectivement les sous-clades SRAS et MERS) (Fig. 2), et la détection de séquences de type coronavirus humain 229E chez les chauves-souris hipposideros et rhinolophus. échantillonné en République de Chine, en Ouganda, au Cameroun et au Gabon, confirmant les suggestions précédentes selon lesquelles 229E aurait des origines zoonotiques ( Pfefferle et al. 2009 Hu et al. 2015). Enfin, nous mettons en évidence la détection de séquences analogues au virus de la bronchite infectieuse aviaire (IBV) chez les chauves-souris et d'un virus étroitement apparenté (PREDICT_CoV-49) chez les primates non humains du Bangladesh, ainsi que le virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV) chez chauves-souris (Fig. 2). Encore une fois, nous confirmons qu'aucun échantillon de bétail n'a été traité dans aucun de ces laboratoires qui aurait pu être une source de contamination.

3.2 Facteurs favorisant la diversité virale

La -diversité virale (le «nombre effectif» d'espèces) était significativement corrélée avec la -diversité des chauves-souris (tau = 0,325, P = 0,022) ( Fig. 3), suggérant que davantage de virus seront trouvés dans les régions où la diversité des chauves-souris est plus élevée. Cette association a été maintenue lorsque la richesse virale, plutôt que le nombre effectif d'espèces, a été utilisée comme indice de diversité (tau = 0,421, P < 0,001). La -diversité virale et chauve-souris était également significativement corrélée (test de Mantel rho = 0,575, P < 0,001). Dans les deux cas, la diversité se différenciait presque entièrement en trois communautés distinctes par région (Fig. 3). Seules l'Afrique et l'Asie ont partagé des clusters de séquences virales (PREDICT_CoV-35 et HKU9 Fig. 4), démontrant que les chauves-souris ont eu une forte influence biogéographique sur l'écologie mondiale et l'évolution des CoV.

Comparaison de la diversité virale et des chauves-souris. La surface de la Terre a été divisée en cellules de grille par latitude et longitude (unités de 10 × 10 degrés) pour les calculs de diversité (Panneau A). Les cellules de la grille où les chauves-souris ont été échantillonnées sont numérotées dans chaque région. La diversité alpha (Shannon H) pour le virus (Panneau B) et l'hôte (Panneau C) ont été corrélées, indiquant que les zones de forte diversité de chauves-souris ont également une forte diversité virale. Les cellules plus sombres indiquent une diversité alpha plus élevée (c'est-à-dire plus de taxons viraux ou hôtes) dans chaque cellule de la grille. La diversité bêta était également corrélée entre le virus (panel D) et l'hôte (panel E), et différenciée en trois communautés distinctes par région : l'Amérique latine (cellules de grille 1 à 10), l'Afrique (cellules de grille 11 à 20) et l'Asie (cellules de grille 1 à 10). cellules 21-34). L'ombrage indique que les virus (en rouge) ou les hôtes (en bleu) sont partagés entre deux cellules de grille correspondantes, les cellules plus sombres indiquant une plus grande similarité par paires.

Comparaison de la diversité virale et des chauves-souris. La surface de la Terre a été divisée en cellules de grille par latitude et longitude (unités de 10 × 10 degrés) pour les calculs de diversité (Panneau A). Les cellules de la grille où les chauves-souris ont été échantillonnées sont numérotées dans chaque région. La diversité alpha (Shannon H) pour le virus (Panneau B) et l'hôte (Panneau C) étaient corrélées, indiquant que les zones à forte diversité de chauves-souris ont également une forte diversité virale. Les cellules plus sombres indiquent une diversité alpha plus élevée (c'est-à-dire plus de taxons viraux ou hôtes) dans chaque cellule de la grille. La diversité bêta était également corrélée entre le virus (partie D) et l'hôte (partie E), et différenciée en trois communautés distinctes par région : l'Amérique latine (cellules de grille 1 à 10), l'Afrique (cellules de grille 11 à 20) et l'Asie (cellules de grille 1 à 10). cellules 21-34). L'ombrage indique que les virus (en rouge) ou les hôtes (en bleu) sont partagés entre deux cellules de grille correspondantes, les cellules plus sombres indiquant une plus grande similarité par paires.

Modèle de réseau montrant la connexion des CoV et de leurs hôtes. Les clusters de séquences virales (colorés en gris) sont connectés aux espèces hôtes, soit par région (Panneau A) soit par famille (Panneau B). Le virus, l'hôte et les communautés se séparent presque entièrement par région, seules l'Afrique et l'Asie sont connectées par deux virus partagés (HKU9 et PREDICT_CoV-35) trouvés dans des espèces des deux continents. Les réseaux montrent également que les virus semblent être partagés par plusieurs familles d'accueil en Afrique et en Asie, tout en étant plus restreints à une seule famille en Amérique latine.

Modèle de réseau montrant la connexion des CoV et de leurs hôtes. Les clusters de séquences virales (colorés en gris) sont connectés aux espèces hôtes, soit par région (Panneau A) soit par famille (Panneau B). Le virus, l'hôte et les communautés se séparent presque entièrement par région, seules l'Afrique et l'Asie sont connectées par deux virus partagés (HKU9 et PREDICT_CoV-35) trouvés dans des espèces des deux continents. Les réseaux montrent également que les virus semblent être partagés par plusieurs familles d'accueil en Afrique et en Asie, tout en étant plus restreints à une seule famille en Amérique latine.

Une analyse de réconciliation co-phylogénétique a été utilisée pour étudier les mécanismes évolutifs à l'origine des associations virus-hôte observées, par exemple le changement d'hôte, le partage viral ou la co-spéciation (voir « Méthodes »). Dans l'ensemble, le changement d'hôte était le mécanisme dominant, suivi de la co-spéciation (Fig. 5). Lorsqu'il est analysé par région, le changement d'hôte (transmission intergenre) est resté dominant en Afrique et en Asie, mais pas en Amérique latine. Malgré moins d'événements de changement d'hôte en Amérique latine, il y a eu une augmentation concomitante du partage de virus (transmission intra-genre). Cela suggère que les virus changent toujours d'hôte en Amérique latine mais se déplacent préférentiellement entre des espèces étroitement apparentées, tandis qu'en Afrique et en Asie, les virus se croisent entre des espèces plus éloignées. Pour évaluer la sensibilité de nos résultats à notre méthode choisie (c'est-à-dire l'utilisation d'un schéma de coûts prédéfini dans le programme Jane), nous avons répété l'analyse pour les reconstructions Quan alpha-CoV et bêta-CoV en utilisant CoRePA, une approche à paramètres adaptatifs qui estime un schéma de coûts approprié sans aucune affectation de valeur préalable. En comparant les résultats, nous avons noté une concordance de 91 % entre Jane et CoRePA dans la reconstruction alpha-CoV (trente-quatre événements, dont trente et un en accord), et une concordance de 100 % dans les reconstructions bêta-CoV (vingt-six événements, tous de qui était d'accord). Nous notons en outre que le schéma de coût calculé dans CoRePA était de 0,7 pour le changement d'hôte et de 0,1 pour la cospéciation, ce qui prend en charge le schéma de coût par défaut utilisé dans Jane (c'est-à-dire que le changement d'hôte doit être considéré comme plus « coûteux » que la cospéciation).

Proportion relative d'événements évolutifs conduisant à des associations virus:hôte observées pour les CoV chez les chauves-souris. Des reconstructions cophylogénétiques ont été utilisées pour identifier chaque événement (Fig. supplémentaire S1 : Panneaux A à D) et l'importance a été évaluée par région. Dans toutes les régions, le changement d'hôte était l'événement évolutif dominant (Panneau A). Lorsqu'ils sont séparés par région, le changement d'hôte est resté dominant en Afrique (Panneau B) et en Asie (Panneau C), mais pas en Amérique latine (Panneau D).

Proportion relative d'événements évolutifs conduisant à des associations virus:hôte observées pour les CoV chez les chauves-souris. Des reconstructions cophylogénétiques ont été utilisées pour identifier chaque événement (Fig. supplémentaire S1 : Panneaux A à D) et l'importance a été évaluée par région. Dans toutes les régions, le changement d'hôte était l'événement évolutif dominant (Panneau A). Lorsqu'ils sont séparés par région, le changement d'hôte est resté dominant en Afrique (Panneau B) et en Asie (Panneau C), mais pas en Amérique latine (Panneau D).

Un modèle de réseau bipartite connectant des grappes de séquences virales à leurs hôtes soutient ces résultats, illustrant que les CoV de chauves-souris étaient connectés à plusieurs familles d'hôtes en Afrique et en Asie tout en étant largement limités à une seule famille de chauves-souris en Amérique latine (Fig. 4, panneau B). De plus, le changement d'hôte était près de quatre fois plus probable que le partage de virus en Afrique, par rapport à l'Amérique latine (OR : 3,858 P = 0,040). Les CoV en Asie étaient également plus susceptibles d'héberger le commutateur que de le partager par rapport à l'Amérique latine, mais les résultats n'étaient pas significatifs (OR : 2,474 P = 0,143). Aucune famille de chauves-souris en particulier n'a été associée à une augmentation du changement d'hôte, mais cela peut refléter de petites tailles d'échantillon lorsque les données sont résumées par famille.

3.3 Nombre estimé de CoV chez les chauves-souris

Un grand nombre d'espèces hôtes (chauves-souris) dans notre étude étaient négatives pour le CoV (n = 197), cependant aucune de ces espèces n'a été largement échantillonnée (Fig. 6). Nous avons constaté que toutes les espèces dont la taille d'échantillon était supérieure à 110 individus étaient positives pour un ou plusieurs CoV, ce qui suggère que nous aurions détecté des CoV dans certaines des espèces négatives de notre étude si l'effort d'échantillonnage avait été augmenté. En raison du nombre élevé de ces espèces négatives et de leur effet sur le nombre moyen de grappes de séquences virales par espèce, elles ont été exclues de nos estimations. En ne retenant que les espèces pour lesquelles >110 individus ont été échantillonnés (il y avait vingt-sept espèces qualifiées), nous avons estimé le nombre moyen de CoV par espèce à 2,67 (std = 1,38), ce qui explique le scénario probable selon lequel certaines espèces ont plus de virus et d'autres moins. Nous avons ensuite extrapolé la moyenne à l'ensemble des 1 200 espèces de chauves-souris pour estimer une richesse potentielle totale de 3 204 CoV (plage = 1 200 à 6 000 CoV), dont la plupart n'ont pas encore été décrites.

Relation entre l'effort d'échantillonnage et la détection virale parmi toutes les espèces de chauves-souris échantillonnées. Un modèle de régression de Poisson a été utilisé pour estimer le nombre attendu de virus en fonction du nombre d'animaux échantillonnés, par espèce (chaque cercle indique une espèce distincte). Les intervalles de confiance à 95 % sont indiqués.

Relation entre l'effort d'échantillonnage et la détection virale parmi toutes les espèces de chauves-souris échantillonnées. Un modèle de régression de Poisson a été utilisé pour estimer le nombre attendu de virus en fonction du nombre d'animaux échantillonnés, par espèce (chaque cercle indique une espèce distincte). Les intervalles de confiance à 95 % sont indiqués.

3.4 Facteurs prédisant la positivité du CoV

Afin d'affiner les futurs efforts de surveillance pour trouver la diversité non découverte des CoV chez les chauves-souris, nous avons évalué les facteurs prédisant la positivité du CoV. Pour chaque région, le meilleur modèle comprenait le type de spécimen, la famille de chauves-souris (ou dans le cas de l'Amérique latine, la sous-famille), la saison et l'interface animal-humain (tableau 2). La saison n'a pas été incluse dans le top model pour l'Amérique latine, mais le modèle avec la saison incluse était dans les deux AIC (delta AIC = 1,06) et donc considéré comme ayant autant de soutien que le top model ( Burnham et Anderson 2002). Le type d'échantillon était fortement associé à la positivité au CoV, et les échantillons contenant des matières fécales ou des écouvillons fécaux étaient significativement plus susceptibles d'être positifs que les autres types d'échantillons dans toutes les régions. La famille des chauves-souris était importante en Asie et en Afrique. La saison était également significative, les échantillons collectés pendant la saison sèche étant plus susceptibles d'être positifs en Afrique et en Asie que ceux collectés pendant la saison des pluies (bien qu'avec de faibles rapports de cotes). La classe d'âge semble être importante, car les sous-adultes étaient plus susceptibles d'être positifs que les adultes en Afrique et en Asie. Le sexe n'était pas lié à la positivité au CoV en Asie ou en Amérique latine, tandis que les hommes étaient légèrement plus susceptibles d'être positifs au CoV en Afrique (OR = 1,5, 1,2-1,9 IC, P < 0,001). De larges catégories d'interfaces animal-humain étaient significativement associées à la positivité au CoV chez les chauves-souris dans les trois régions : en Afrique et en Amérique latine, les chauves-souris échantillonnées dans la catégorie de l'interface d'utilisation des animaux étaient plus susceptibles d'être positives, et en Asie, les chauves-souris échantillonnées sur l'animal les interfaces d'utilisation et d'activités humaines étaient plus susceptibles d'être positives que celles échantillonnées à d'autres interfaces. L'importance de l'interface animale dans les trois régions suggère que les pratiques autour de l'utilisation des animaux peuvent être importantes pour la transmission des maladies.

Variables associées aux tests de chauves-souris positifs pour le coronavirus en Afrique, en Asie et en Amérique latine. Les ensembles de données régionales pour chaque modèle de régression logistique se composaient d'espèces de chauves-souris pour lesquelles plus de cinquante chauves-souris ont été testées. Les ensembles de données d'âge étaient un sous-ensemble des ensembles de données régionaux, car la classe d'âge n'était pas déterminée pour tous les individus. Les nombres en gras sont statiquement significatifs pour P < 0.05.

. . . Rapport de cotes. P . Intervalles de confiance à 95 % .
Afrique
Échantillon type Inférieur Supérieur
Fèces/écouvillon rectal 350.98<0.001146.64840.07
Écouvillon buccal/nasal 5.05<0.0012.0312.54
Écouvillon buccal/rectal 30.98<0.00113.4671.30
Du sang 1.65 0.540 0.33 8.09
Tissu 1.00
Famille d'accueil
Hipposidéridés 1.22 0.559 0.62 2.41
Ptéropodidés 3.84 <0.0012.276.49
Molossidés 1.00
Saison
Sécher 2.42 <0.0011.793.25
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 1.98 0.0011.352.91
Zone vierge 1.39 0.624 0.37 5.29
L'utilisation des terres 1.66 0.219 0.74 3.74
Activité humaine 1.00
Âge
Subadulte 5.91<0.0014.288.17
Adulte 1.00
Asie
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 62.80<0.00115.44255.49
Écouvillonnage buccal/nasal 13.25<0.0013.1156.38
Écouvillonnage urinaire/urogénital 46.92<0.00110.85202.80
Guano 22.12<0.0013.66133.56
Tissu, écouvillon buccal/rectal 1.00
Famille d'accueil
Emballonuridés 0.31 0.26 0.04 2.37
Minioptéridés 9.78<0.0015.6916.81
Ptéropodidés 2.16<0.0011.293.62
Rhinolophidés 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidés 3.67<0.0012.186.18
Hipposidéridés 1.00
Saison
Sécher 1.490.031.032.16
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 3.300.011.298.40
Activité humaine 3.480.011.368.95
Zone vierge 1.81 0.35 0.52 6.35
L'utilisation des terres 1.00
Âge
Subadulte 1.840.001.262.67
Adulte 1.00
l'Amérique latine
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 15.660.0005.0248.79
Écouvillon buccal/rectal 27.860.0006.86113.22
Écouvillonnage buccal/nasal 1.00
Sous-famille d'accueil
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Sténodermatines 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interface
Utilisation animale 5.250.011.4818.65
Activité humaine 2.73 0.12 0.77 9.69
L'utilisation des terres 4.22 0.10 0.78 22.95
Zone vierge 1.00
Saison
Sécher 1.30 0.52 0.58 2.89
Mouiller 1.00
Âge
Subadulte 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulte 1.00
. . . Rapport de cotes. P . Intervalles de confiance à 95 % .
Afrique
Échantillon type Inférieur Supérieur
Fèces/écouvillon rectal 350.98<0.001146.64840.07
Écouvillonnage buccal/nasal 5.05<0.0012.0312.54
Écouvillon buccal/rectal 30.98<0.00113.4671.30
Du sang 1.65 0.540 0.33 8.09
Tissu 1.00
Famille d'accueil
Hipposidéridés 1.22 0.559 0.62 2.41
Ptéropodidés 3.84 <0.0012.276.49
Molossidés 1.00
Saison
Sécher 2.42 <0.0011.793.25
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 1.98 0.0011.352.91
Zone vierge 1.39 0.624 0.37 5.29
L'utilisation des terres 1.66 0.219 0.74 3.74
Activité humaine 1.00
Âge
Subadulte 5.91<0.0014.288.17
Adulte 1.00
Asie
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 62.80<0.00115.44255.49
Écouvillon buccal/nasal 13.25<0.0013.1156.38
Écouvillonnage urinaire/urogénital 46.92<0.00110.85202.80
Guano 22.12<0.0013.66133.56
Tissu, écouvillon buccal/rectal 1.00
Famille d'accueil
Emballonuridés 0.31 0.26 0.04 2.37
Minioptéridés 9.78<0.0015.6916.81
Ptéropodidés 2.16<0.0011.293.62
Rhinolophidés 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidés 3.67<0.0012.186.18
Hipposidéridés 1.00
Saison
Sécher 1.490.031.032.16
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 3.300.011.298.40
Activité humaine 3.480.011.368.95
Zone vierge 1.81 0.35 0.52 6.35
L'utilisation des terres 1.00
Âge
Subadulte 1.840.001.262.67
Adulte 1.00
l'Amérique latine
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 15.660.0005.0248.79
Écouvillon buccal/rectal 27.860.0006.86113.22
Écouvillon buccal/nasal 1.00
Sous-famille d'accueil
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Sténodermatines 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interface
Utilisation animale 5.250.011.4818.65
Activité humaine 2.73 0.12 0.77 9.69
L'utilisation des terres 4.22 0.10 0.78 22.95
Zone vierge 1.00
Saison
Sécher 1.30 0.52 0.58 2.89
Mouiller 1.00
Âge
Subadulte 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulte 1.00

Variables associées aux tests de chauves-souris positifs pour le coronavirus en Afrique, en Asie et en Amérique latine. Les ensembles de données régionales pour chaque modèle de régression logistique se composaient d'espèces de chauves-souris pour lesquelles plus de cinquante chauves-souris ont été testées. Les ensembles de données d'âge étaient un sous-ensemble des ensembles de données régionaux, car la classe d'âge n'était pas déterminée pour tous les individus. Les nombres en gras sont statiquement significatifs pour P < 0.05.

. . . Rapport de cotes. P . Intervalles de confiance à 95 % .
Afrique
Échantillon type Inférieur Supérieur
Fèces/écouvillon rectal 350.98<0.001146.64840.07
Écouvillon buccal/nasal 5.05<0.0012.0312.54
Écouvillon buccal/rectal 30.98<0.00113.4671.30
Du sang 1.65 0.540 0.33 8.09
Tissu 1.00
Famille d'accueil
Hipposidéridés 1.22 0.559 0.62 2.41
Ptéropodidés 3.84 <0.0012.276.49
Molossidés 1.00
Saison
Sécher 2.42 <0.0011.793.25
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 1.98 0.0011.352.91
Zone vierge 1.39 0.624 0.37 5.29
L'utilisation des terres 1.66 0.219 0.74 3.74
Activité humaine 1.00
Âge
Subadulte 5.91<0.0014.288.17
Adulte 1.00
Asie
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 62.80<0.00115.44255.49
Écouvillon buccal/nasal 13.25<0.0013.1156.38
Écouvillonnage urinaire/urogénital 46.92<0.00110.85202.80
Guano 22.12<0.0013.66133.56
Tissu, écouvillon buccal/rectal 1.00
Famille d'accueil
Emballonuridés 0.31 0.26 0.04 2.37
Minioptéridés 9.78<0.0015.6916.81
Ptéropodidés 2.16<0.0011.293.62
Rhinolophidés 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidés 3.67<0.0012.186.18
Hipposidéridés 1.00
Saison
Sécher 1.490.031.032.16
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 3.300.011.298.40
Activité humaine 3.480.011.368.95
Zone vierge 1.81 0.35 0.52 6.35
L'utilisation des terres 1.00
Âge
Subadulte 1.840.001.262.67
Adulte 1.00
l'Amérique latine
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 15.660.0005.0248.79
Écouvillon buccal/rectal 27.860.0006.86113.22
Écouvillon buccal/nasal 1.00
Sous-famille d'accueil
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Sténodermatines 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interface
Utilisation animale 5.250.011.4818.65
Activité humaine 2.73 0.12 0.77 9.69
L'utilisation des terres 4.22 0.10 0.78 22.95
Zone vierge 1.00
Saison
Sécher 1.30 0.52 0.58 2.89
Mouiller 1.00
Âge
Subadulte 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulte 1.00
. . . Rapport de cotes. P . Intervalles de confiance à 95 % .
Afrique
Échantillon type Inférieur Supérieur
Fèces/écouvillon rectal 350.98<0.001146.64840.07
Écouvillon buccal/nasal 5.05<0.0012.0312.54
Écouvillon buccal/rectal 30.98<0.00113.4671.30
Du sang 1.65 0.540 0.33 8.09
Tissu 1.00
Famille d'accueil
Hipposidéridés 1.22 0.559 0.62 2.41
Ptéropodidés 3.84 <0.0012.276.49
Molossidés 1.00
Saison
Sécher 2.42 <0.0011.793.25
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 1.98 0.0011.352.91
Zone vierge 1.39 0.624 0.37 5.29
L'utilisation des terres 1.66 0.219 0.74 3.74
Activité humaine 1.00
Âge
Subadulte 5.91<0.0014.288.17
Adulte 1.00
Asie
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 62.80<0.00115.44255.49
Écouvillon buccal/nasal 13.25<0.0013.1156.38
Écouvillonnage urinaire/urogénital 46.92<0.00110.85202.80
Guano 22.12<0.0013.66133.56
Tissu, écouvillon buccal/rectal 1.00
Famille d'accueil
Emballonuridés 0.31 0.26 0.04 2.37
Minioptéridés 9.78<0.0015.6916.81
Ptéropodidés 2.16<0.0011.293.62
Rhinolophidés 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidés 3.67<0.0012.186.18
Hipposidéridés 1.00
Saison
Sécher 1.490.031.032.16
Mouiller 1.00
Interface
Utilisation animale 3.300.011.298.40
Activité humaine 3.480.011.368.95
Zone vierge 1.81 0.35 0.52 6.35
L'utilisation des terres 1.00
Âge
Subadulte 1.840.001.262.67
Adulte 1.00
l'Amérique latine
Échantillon type
Fèces/écouvillon rectal 15.660.0005.0248.79
Écouvillon buccal/rectal 27.860.0006.86113.22
Écouvillon buccal/nasal 1.00
Sous-famille d'accueil
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Sténodermatines 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interface
Utilisation animale 5.250.011.4818.65
Activité humaine 2.73 0.12 0.77 9.69
L'utilisation des terres 4.22 0.10 0.78 22.95
Zone vierge 1.00
Saison
Sécher 1.30 0.52 0.58 2.89
Mouiller 1.00
Âge
Subadulte 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulte 1.00

3.5 Effort d'échantillonnage futur

Sur la base de notre étude, nous avons pu estimer l'effort d'échantillonnage qui serait nécessaire pour trouver tous les CoV chez les chauves-souris, sur la base d'un modèle de régression de Poisson de nos données (Fig. 6). Avec 154 individus, nous estimons qu'en moyenne un CoV sera détecté (IC 95% 136-177). Avec 397 individus, nous estimons que jusqu'à cinq CoV seront détectés (IC à 95 % 351-458). Comme nous n'avons observé aucune espèce avec plus de cinq grappes de séquences virales, nous supposons que l'échantillonnage de 397 individus devrait capturer toute la diversité des CoV dans chaque espèce de chauve-souris.

3.6 Prédire la distribution des CoV inconnus

Le sous-clade viral et la famille hôte n'étaient pas indépendants l'un de l'autre (χ 2 par clade = P < 0,001 Tableau supplémentaire S1 ), démontrant que différents clades ont des associations significatives avec des familles de chauves-souris spécifiques. Par exemple, les CoV 2d du sous-groupe étaient significativement associés aux chauves-souris ptéropides et n'ont été identifiés que dans les régions où existent des chauves-souris ptéropides. De même, les CoV du sous-groupe 2b étaient associés aux chauves-souris rhinoophides et hipposirides et le 2c aux chauves-souris vespertilionides. Pour « prédire » la distribution potentielle des CoV inconnus, nous avons tracé la distribution connue des chauves-souris appartenant à ces familles et supposons que les « points chauds » de diversité des chauves-souris déduisent des points chauds de diversité virale pour chaque sous-clade (Fig. 7). Nous notons que le genre alphaCoV a été considéré comme un seul groupe, car ils ne se résolvent pas bien en sous-clades ( de Groot et al. 2009), et qu'aucune carte 2a n'a été générée étant donné qu'un seul virus de chauve-souris de ce clade a été identifié .

Cartes des « points chauds » de la diversité virale. Le panneau A montre les points chauds potentiels pour les CoV en fonction de la répartition des chauves-souris dans le monde. L'emplacement des séquences alpha CoV de cette étude est indiqué en noir et les séquences bêta CoV en bleu, indiquant qu'il n'y a pas de biais géographique basé sur le genre viral (c'est-à-dire que les CoV alpha et bêta sont également susceptibles d'être trouvés dans toutes les régions). Certains sous-clades viraux étaient associés à des familles de chauves-souris particulières, et les données de distribution spatiale de toutes les espèces appartenant à ces familles ont été tracées pour indiquer les points chauds potentiels de diversité virale (richesse) pour ces sous-clades. Le panneau B indique la distribution potentielle des CoV 2b sur la base de la distribution des chauves-souris rhinolphus et hipposideros. Les emplacements des animaux 2b-positifs identifiés dans cette étude sont indiqués en noir et sont en corrélation avec les zones de grande richesse en espèces (pour ces familles). Animaux CoV-positifs pour les autres sous-clades indiqués en bleu clair. Le panneau C indique la distribution potentielle des CoV 2c sur la base de la distribution des chauves-souris vespertilionides. Les emplacements des animaux 2c-positifs identifiés dans cette étude sont indiqués en noir. Cette carte suggère qu'il existe des points chauds de diversité 2c dans des régions non couvertes par cette étude (par exemple, l'Europe). Le panneau D indique la distribution potentielle des virus 2d sur la base de la distribution des chauves-souris ptéropides. La carte suggère que ces virus peuvent avoir une distribution plus limitée, par rapport aux virus d'autres sous-clades. Les emplacements des animaux 2d-positifs identifiés dans cette étude sont indiqués en noir.

Cartes des « points chauds » de la diversité virale. Le panneau A montre les points chauds potentiels pour les CoV en fonction de la répartition des chauves-souris dans le monde. L'emplacement des séquences alpha CoV de cette étude est indiqué en noir et les séquences bêta CoV en bleu, indiquant qu'il n'y a pas de biais géographique basé sur le genre viral (c'est-à-dire que les CoV alpha et bêta sont également susceptibles d'être trouvés dans toutes les régions). Certains sous-clades viraux étaient associés à des familles de chauves-souris particulières, et les données de distribution spatiale de toutes les espèces appartenant à ces familles ont été tracées pour indiquer les points chauds potentiels de diversité virale (richesse) pour ces sous-clades. Le panneau B indique la distribution potentielle des CoV 2b sur la base de la distribution des chauves-souris rhinolphus et hipposideros. Les emplacements des animaux 2b-positifs identifiés dans cette étude sont indiqués en noir et sont en corrélation avec les zones de grande richesse en espèces (pour ces familles). Animaux CoV-positifs pour les autres sous-clades indiqués en bleu clair. Le panneau C indique la distribution potentielle des CoV 2c sur la base de la distribution des chauves-souris vespertilionides. Les emplacements des animaux 2c-positifs identifiés dans cette étude sont indiqués en noir. Cette carte suggère qu'il existe des points chauds de diversité 2c dans des régions non couvertes par cette étude (par exemple, l'Europe). Le panneau D indique la distribution potentielle des virus 2d sur la base de la distribution des chauves-souris ptéropides. La carte suggère que ces virus peuvent avoir une distribution plus limitée, par rapport aux virus d'autres sous-clades. Les emplacements des animaux 2d-positifs identifiés dans cette étude sont indiqués en noir.


Le système modèle de Mendel

Le petit pois possède plusieurs caractéristiques avantageuses qui ont permis à Mendel de développer les lois de la génétique moderne.

Objectifs d'apprentissage

Décrire les raisons scientifiques du succès des travaux expérimentaux de Mendel

Points clés à retenir

Points clés

  • Mendel a utilisé des plantes de reproduction pure dans ses expériences. Ces plantes, lorsqu'elles s'autofécondent, produisent toujours une progéniture avec le même phénotype.
  • Les plants de pois sont faciles à manipuler, poussent en une seule saison et peuvent être cultivés en grandes quantités. Ces qualités ont permis à Mendel de mener des analyses quantitatives méthodiques en utilisant de grands échantillons.
  • Sur la base de ses expériences avec les petits pois, Mendel a découvert qu'un phénotype était toujours dominant sur un autre phénotype récessif pour le même caractère.

Mots clés

  • phénotype: les caractéristiques observables d'un organisme, résultant souvent de son information génétique ou d'une combinaison d'information génétique et de facteurs environnementaux
  • génotype: l'information génétique spécifique d'une cellule ou d'un organisme, généralement une description de l'allèle ou des allèles relatifs à un gène spécifique.
  • plante d'élevage: une plante qui produit toujours une progéniture du même phénotype lorsqu'elle est autofécondée, une plante homozygote pour le caractère suivi.

Système de modèle Mendel’s

Le travail fondateur de Mendel a été accompli en utilisant le petit pois, Pisum sativum, pour étudier l'héritage. La reproduction des pois est facilement manipulée. De grandes quantités de petits pois pouvaient être cultivées simultanément, permettant à Mendel de conclure que ses résultats ne sont pas le fruit du hasard. Le pois potager atteint également la maturité en une seule saison, plusieurs générations pourraient être évaluées sur une période relativement courte.

Les plants de pois ont des parties mâles et femelles et peuvent facilement être cultivés en grand nombre. Pour cette raison, les plants de pois de jardin peuvent s'autoféconder ou se polliniser avec d'autres plants de pois. En l'absence de manipulation extérieure, cette espèce s'autoféconde naturellement : les ovules (les œufs) au sein des fleurs individuelles sont fécondés par le pollen (contenant le spermatozoïde) de la même fleur. Le sperme et les œufs qui produisent la prochaine génération de plantes proviennent tous deux du même parent. De plus, les pétales des fleurs restent hermétiquement scellés jusqu'après la pollinisation, empêchant la pollinisation par d'autres plantes. Le résultat est des plants de pois hautement consanguins, ou de « vraie sélection ». Ce sont des plantes qui produisent toujours une progéniture qui ressemble au parent. Aujourd'hui, nous savons que ces plantes de « vraie sélection » sont homozygotes pour la plupart des caractères.

Un jardinier ou un chercheur, comme Mendel, peut polliniser ces mêmes plantes en appliquant manuellement le sperme d'une plante sur le pistil (contenant les ovules) d'une autre plante. Maintenant, le sperme et les œufs proviennent de différentes plantes mères. Lorsque Mendel a pollinisé par croisement une plante de reproduction pure qui ne produisait que des pois jaunes avec une plante de reproduction vraie qui ne produisait que des pois verts, il a découvert que la première génération de la progéniture est toujours composée de pois jaunes. Le trait de pois vert ne s'est pas manifesté. Cependant, si cette première génération de plants de pois jaunes était autorisée à s'autoféconder, la génération suivante ou la deuxième génération présentait un rapport de 3:1 entre les pois jaunes et les pois verts.

Dans ce trait et dans tous les autres traits de pois suivis par Mendel, une forme du trait était "dominante" sur une autre, ce qui masquait la présence de l'autre forme "récessive" dans la première génération après le croisement de deux plantes homozygotes .. Même si le phénotype (forme visible) est caché, le génotype (allèle contrôlant cette forme du trait) peut être transmis à la génération suivante et produire la forme récessive dans la deuxième génération. En expérimentant avec des plants de pois de race pure, Mendel a évité l'apparition de traits inattendus (recombinants) dans la progéniture qui pourraient se produire si les plants n'étaient pas de vrais croisements.

Les expériences de Mendel avec les pois: Expérimentant avec des milliers de petits pois, Mendel a découvert les bases de la génétique.


Source et description des souches parentales

FGSC4200 et FGSC2489 étaient un cadeau de Tian Chaoguang, Institut de biotechnologie industrielle de Tianjin, Académie chinoise des sciences, Chine. FGSC2225 était un cadeau de Li Shaojie, State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, China. FGSC3246 et FGSC1363 ont été achetés auprès du Fungal Genetics Stock Center, Department of Plant Pathology, Kansas State University, USA.

Les FGSC 2489 et 4200 sont des souches hautement consanguines et sont préférées pour une utilisation en tant que types sauvages standard [29]. FGSC 4200 est une descendance du 6e rétrocroisement avec FGSC 2489 (la souche du génome de référence) de FGSC 2490. FGSC 2225 (Mauriceville-1cA, collecté à Mauriceville, TX, USA) est une souche isolée de la nature [30]. La souche FGSC 1363 est un mutant morphologique qui commence sa croissance sur gélose sous forme de petites colonies et produit tôt ou tard une poussée d'hyphes de type sauvage (avec ou sans conidies) [31]. FGSC 3246 est un mutant stérile femelle [32]. D'après le profil SNP, il n'y a aucune raison de supposer qu'il s'agit d'hyper-mutateurs [33]. Un examen préalable de la RIP dans la nature n'a identifié que très peu d'isolats sauvages qui suppriment de manière dominante la RIP [34, 35], suggérant des propriétés similaires de ces souches de laboratoire dans le déclenchement de la RIP comme dans la nature.

Dissection en croix et ascospores

Tous les croisements ont été accouplés et incubés dans des conditions de laboratoire. Pour éviter la contamination, tous les milieux de culture, ainsi que les plaques, ont été autoclavés à

121 °C pendant plus de 25 min dans un stérilisateur à vapeur haute pression (TOMY SX-500) avant chaque expérience. Les procédures ultérieures ont été menées sur des paillasses propres qui avaient été stérilisées à l'aide d'ultraviolets juste avant l'expérience. Le milieu de culture et les méthodes expérimentales utilisés dans cette recherche étaient basés sur les protocoles proposés par le Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). En bref, du mycélium ou des ascospores de deux souches d'accouplement ont été étalés à l'extrémité opposée de la plaque d'accouplement. Si une ascospore était utilisée comme parent reproducteur, la spore était soumise à un choc thermique à 60 °C, 30 min avant le placage. Les plaques de croisement ont été incubées à 25 °C dans un environnement totalement sombre. Après environ 3 semaines de croissance et de croisement, les asques ont été séparés et prélevés sur un milieu de stockage pendant une semaine. Un asque a été prélevé sur milieu gélosé et incubé à 60°C, 30 min. Ensuite, l'asque a été disséqué au microscope. Chaque ascospore a été prélevée une par une sur son propre milieu de croissance. Pour la croix G, deux ascospores avec des types d'accouplement opposés de la croix C ont été isolées et placées sur la même plaque de croisement, qui avait subi une série de reproduction sexuée (Fig. 1a). Les deux spores pour la propagation asexuée provenaient de deux ascospores du croisement de FGSC2225 et FGSC4200.

Extraction d'ADN et reséquençage du génome entier

Chacune des ascospores disséquées a été cultivée individuellement sur sa propre plaque pendant environ 3 jours afin de permettre l'extraction de 3 microgrammes ou plus d'ADN. L'ADN a été extrait par la méthode phénol/chloroforme/alcool isoamylique [36]. L'échantillon d'ADN de chaque culture a été extrait et re-séquencé individuellement.

Le reséquençage du génome entier a été réalisé chez Novogene (www.novogene.com) avec le même protocole pour tous, impliquant 2 lectures appariées de 150 pb construites par la plateforme Illumina HiSeq 4000. Deux cent soixante-treize N. crassa des échantillons (dont 5 souches parentales et 67 tétrades) ont été séquencés au total. En moyenne, chaque spore a été séquencée à une profondeur de

37 fois avec 96% du génome couvert. Les souches parentales ont été séquencées à une profondeur de

97 % du génome de référence couvert (Fichier complémentaire 2 : Fiche technique S1). Plus de 92 % du génome de référence pourrait être couvert par au moins cinq lectures dans chaque échantillon séquencé, avec un taux d'erreur de mappage inférieur à 1 % (Fichier supplémentaire 2 : Fiche technique S1).

Identification des mutations

Par souci de cohérence avec les estimations antérieures du taux de mutation (dans différentes espèces), et parce que l'appel indel est sujet aux artefacts d'analyse, nous limitons l'analyse aux mutations ponctuelles. Les lectures de reséquençage ont été mappées sur le génome de référence NC12 (https://www.broadinstitute.org/fungal-genome-initiative/neurospora-crassa-genome-project) à l'aide d'un aligneur BWA [37]. Les variantes ont été appelées par HaplotypeCaller de Genome Analysis Toolkit (GATK) [38]. Les variantes brutes ont été filtrées en supprimant celles qui n'étaient pas qualifiées d'homozygotes ou dont le score de qualité était inférieur à 30. Compte tenu de la nature haploïde des échantillons, les nouvelles mutations devraient toutes être qualifiées d'homozygotes.

Pour être considérées comme des mutations candidates, nous avons eu besoin de filtres supplémentaires. Les sites variants dans les ascospores de la progéniture devaient être (i) différents de leurs parents et (ii) avoir une profondeur de lecture de support ≥ 5 à la fois dans le parent source et les ascospores focales. Chaque mutation candidate a ensuite été inspectée manuellement pour supprimer les résultats ambigus, y compris (1) les erreurs de séquençage, en particulier dans les régions polymères (2) les variantes qui existaient réellement dans les échantillons parents mais n'ont pas été capturées par les appelants de variantes et (3) les artefacts d'alignements parasites.

Bien que nous ayons été particulièrement prudents à chaque étape des expériences, nous ne pouvons pas être sûrs à 100 % qu'aucune contamination n'était présente dans l'ADN séquencé. Cependant, nous notons que la contamination ne doit pas confondre notre mutation appelant pour plusieurs raisons. Premièrement, s'ils ont une chance d'être mappés sur le génome de référence, les contaminants donneront généralement de faux « appels de variantes hétérozygotes », mais toutes les mutations que nous employons sont homozygotes. Les « appels homozygotes » de la contamination ne se produiraient que dans les rares cas où le contaminant pourrait être mappé sur des régions présentant de grandes délétions dans la souche séquencée (c'est-à-dire que le contaminant est plus similaire au génome de référence qu'à la souche séquencée). Deuxièmement, les contaminants donnent généralement des alignements parasites avec des extrémités de lecture coupées car ils ont tendance à ne pas bien correspondre au génome de référence, de tels alignements étant rejetés lors de l'appel de mutation. Troisièmement, on s'attend à ce que les contaminants soient distribués au hasard parmi tous les échantillons collectés, mais les mutations sont séparées de 2:2 ou 3::1 et généralement présentes dans un seul asque.

Nous estimons le taux de faux positifs par reséquençage de Sanger. Sur 186 mutations sélectionnées au hasard pour la vérification de Sanger (Fichier supplémentaire 1 : Figure S6 et Fichier supplémentaire 2 : Fiche technique S3), 14 n'ont pas pu être séquencées Sanger : trois avaient un séquençage Sanger bruyant tandis que 11 amplifiaient la mauvaise séquence. Dans les 172 séquençages Sanger réussis, toutes les mutations ont été vérifiées. On suppose donc un taux de faux positifs nul.

Les faux négatifs (FN) ont été estimés en utilisant deux approches. La première approche utilise une méthode de simulation similaire à celle décrite précédemment [39]. La distribution empirique de la profondeur de lecture a été échantillonnée à partir des mutations réelles identifiées. Pour chaque croisement sexuel, 5000 sites de mutation synthétique 2:2 et 1000 sites de mutation synthétique 3::1 ont été générés. Pour chaque lignée asexuée, 1000 sites de mutation synthétiques ont été générés. Les mutations synthétiques ont été détectées par les mêmes pipelines, et la proportion de mutations correctement identifiées (1 taux de faux négatifs (FNR)) a été calculée comme « mutations synthétiques identifiées »/« mutations synthétiques générées » pour chaque asque.Les doublons étant plus sujets aux erreurs de cartographie que les non doublons, ce FNR a été calculé séparément pour trois régions (désignées par FNR régional ci-après), c'est-à-dire au sein des doublons (définis par Dup-Blast), près des doublons (400 pb en amont et en aval de doublons) et non doublons (Fichier complémentaire 2 : Fiche technique S6).

La seconde approche est basée sur les résultats du séquençage de Sanger (Fichier supplémentaire 2 : Fiche technique S3). Le séquençage de Sanger détecte 16 mutations qui correspondent à des sites avec une faible couverture antérieure (< 5 lectures). Cela suggère un taux de faux négatifs de 16/(172 + 16) = 8,51 %, approximativement en accord avec la simulation ci-dessus dans les quasi/non doublons mais inférieur à celui dans les doublons.

Nous prenons en compte le taux de FNR lors de l'estimation des taux de mutation. Nous avons d'abord normalisé les nombres observés en « nombre de mutations identifiées »/(1-« FNR régional »), le FNR étant spécifique à chaque asque, le FNR exprimé en fraction. Le taux de mutation par génome pour chaque croisement a été calculé comme « nombre moyen de mutations normalisées par asque »/« 2 parents sources » et le taux par pb a été calculé comme « taux par génome normalisé »/« taille du génome de référence ». En moyenne, il y a 135,3 ± 21,4 (sem) mutations de substitution de base détectées avec un rapport de ségrégation de 2:2, équivalent à 3,34 × 10 −6 ± 5,29 × 10 −7 (sem) par site et par génération sexuée (tableau 1).

Alors que nous cartographions par référence au génome publié, nous examinons également les domaines génomiques avec une couverture de lecture deux fois plus élevée que prévu en supposant qu'il s'agit de duplications spontanées récentes. Les doublons spontanés putatifs au cours du cycle sexuel ont d'abord été identifiés en recherchant des doublons 2× uniquement présents dans chaque asque mais non présents dans les souches parentales et avec un rapport de 2:2. Une autre approche, DELLY [40], qui intègre l'analyse appariée et split-read, a ensuite été appliquée pour confirmer les candidats initiaux, et seuls ceux qui ont pu être confirmés par DELLY ont été retenus dans les résultats finaux. Celles-ci semblent rares (pas plus de 1% de la séquence, Fichier complémentaire 2 : Fiche technique S4).

Définition des séquences dupliquées

Notre méthode par défaut pour définir les séquences dupliquées utilise un critère de plus de 65% d'identité [19] et d'au moins 100 pb de séquence alignable [6] (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2, Tableau S3 et Fichier supplémentaire 2 : Fiche technique S4). Cette méthode pour définir ce qui constitue une région dupliquée aux yeux de RIP semble être efficace, c'est-à-dire qu'une fraction élevée du pourcentage de mutations 2:2 fait appel au pourcentage de séquence génomique identifiée (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S3).

Cela a été choisi comme valeur par défaut car il a donné les meilleurs résultats. Au total, nous avons étudié quatre méthodes de définition possibles. Comme ci-dessus, les doublons peuvent être classés en fonction de la recherche Blast (l'identité de 65% et la longueur alignable de 100 pb utilisées ci-dessus), que nous appelons la méthode Dup-Blast, ou en tant que régions avec une profondeur de séquençage 2× en moyenne (Dup-Depth), ou comme des régions portant des allèles « hétérozygotes » (une signature d'erreur de mappage, Dup-Het), ou comme des régions qui suivent la période d'appariement définie par Kleckner [6, 20] (Dup-Period, une période d'appariement de 10

12 ont été utilisés ici) (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S3). Toutes les autres méthodes isolées identifient un pourcentage inférieur de mutations tout en décrivant une proportion plus élevée de séquence génomique (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2 et tableau S3). La fusion de toutes ces signatures suggérerait qu'au plus 40 % du génome (16 Mb) pourrait être « dupliqué », tandis que les 60 % restants ne le sont pas. Étonnamment, la proportion de mutations 2:2 passe de 87,4% pour Dup-Blast à seulement 92,3% dans ces 40%, suggérant que les 16% du génome appelé Dup-Blast capturent efficacement la proportion du génome que RIP considère être dupliqué. Plus précisément, nous avons trouvé qu'environ 32,7% des mutations 2:2 précédemment définies comme des mutations associées non en double (c'est-à-dire non Dup-Blast) pourraient être attribuées aux domaines Dup-Depth/Het/Period (Fichier supplémentaire 2 : Fiche technique S2) .

Test de permutation pour les clusters de mutation

Un cluster de mutations a été défini comme ayant au moins deux mutations dans 1 kb dans un seul génome haploïde (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4). Comme chaque groupe de mutations, en particulier ceux à l'intérieur des doublons, ne se compose généralement que de mutations exclusivement C → T ou exclusivement G → A, elles ont très probablement été générées à partir d'un seul cycle de RIP. Pour tester si le nombre de « mutations groupées » dans les doublons était différent des distributions aléatoires, nous avons redistribué les mutations au hasard dans les 16 % du génome qui sont en double, en choisissant des sites G:C sélectionnés au hasard dans ces domaines dans chaque haploïde. génome du même asque. Pour chaque simulation, nous avons compté le nombre de mutations qui correspondent à la définition d'un cluster. Les P (taux d'erreur de type I attendu) a été dérivée de 10 000 randomisations comme (m + 1)/(m + 1), où m est le nombre d'observations avec autant ou plus de mutations groupées que celle observée et m est le nombre de randomisation. Nous avons utilisé cette méthode pour demander s'il y a plus de clusters dans les domaines en double étant donné les positions des résidus G et C dans les domaines en double.

Comme nous définissons les clusters exclusivement sur la base des emplacements des mutations observées dans le même génome haploïde, il est possible que les clusters identifiés dans une spore se chevauchent avec les clusters identifiés dans une spore différente. L'étendue du chevauchement des clusters (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4) a été testée en mélangeant tous les clusters dans les doublons parmi les tétrades à l'aide de la commande « shuffle » de BEDTools [41]. Dix mille randomisations ont été effectuées pour obtenir le P valeur, comme (m + 1)/(m + 1), où m est le nombre d'observations avec le même nombre ou plus de mutations observées dans les grappes se chevauchant aléatoirement que celle observée dans les grappes réelles et m est le nombre de randomisations. Les pipelines associés sont disponibles sur https://github.com/wl13/Neurospora_mutation. Tous les tests statistiques ont été réalisés dans R [42].

Estimation de Ne

Pour l'estimation de la taille effective de la population, nous avons utilisé le recueil d'hétérozygotie (??) les mesures fournies par Lynch et al. [1]. Nous avons utilisé leur compendium des taux de mutation (??) en plus des nôtres. Ne était alors défini comme Ne = / μ D (1 – π), où est l'ajustement de la ploïdie (2 pour les espèces haploïdes, 4 pour les diploïdes). Les taux de mutation dans les CDS ont été estimés directement par nos soins pour Neurospora (plutôt qu'extrapolé à partir des taux de mutation génomique mis à l'échelle de la proportion de séquence qui est CDS) mais autrement tiré de ce recueil antérieur. Le tableau de données révisé est présenté en tant que fichier supplémentaire 1 : tableau S7.

Analyse des caractéristiques des régions dupliquées

Les informations sur les régions centromériques ont été obtenues auprès de Smith et al. [43]. Les longueurs, les contenus GC et les meilleures identités BLAST pour différentes régions dupliquées (Dup-Blast) sont résumés dans le fichier supplémentaire 1 : Tableau S8. Pour rechercher si une certaine région a subi une RIP, la méthode « RIP index » [44] a été appliquée avec un seuil de TpA/ApT > 2 ou (CpA + TpG)/(ApC + GpT) < 0,7 [19]. Les données Hi-C de Galazka et al. [45] a été utilisé pour rechercher des régions en interaction après avoir disséqué les génomes dans des fenêtres de 10 ko (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S9).